实验一　　大肠杆菌杂交及基因定位

一、原理

大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株（Hfr）的染色体上整合有F因子，当Hfr细菌与F^－细菌细胞发生接合（即杂交）时Hfr细胞（供体菌）的染色体从Hfr细胞向F^－细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据结合后F^－细菌（以重组子形式选出）中Hfr细菌染色体基因出现次数的多少，即可得知基因转移的先后顺序，也就是说基因在染色体上排列的顺序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入F^－细胞的机率大，重组频率高，远离转移起始点的基因进入F^－细胞的机会少，重组率低，F因子大部分位于转移起始点相对的一端（末端）。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足以使整个染色体转入F^－细胞（受体）时，才会使F^－细胞转变为Hfr或F^＋状态。

基因定位时首先要从Hfr与F^－细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F^－细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其它的Hfr基因（非选择标记）出现的次数。Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以100％的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于100％的频率出现在重组子中。F^－细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的F^－菌株为Str^r, Hfr菌为Str^s,借此可排除Hfr菌的生长。另一方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率，F^－细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F^－细菌接合（10～20：1）。

二、目的

通过本实验，了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。

三、材料、试剂与器具

1、受体菌：FD1004　F^－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT str^r rif^r。

2、供体菌：CSH60 Hfr sup str^s。

3、生理盐水：0.85%NaCl。

4、10×A缓中液。

5、基本培养基。

6、LB培养基。

7、选择培养基[B]—[G]：基本培养基加氨基酸（表1－2）。

8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。

四、操作步骤

1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和受体菌于5ml LB培养液中，37℃振荡培养10－12小时。

2、第二天清晨，各取1ml过夜培养物，分别加入到2个盛有5ml LB培养液的250ml三角瓶，37℃振荡培养2－3小时。

3、吸取0.5ml供体菌和4.5ml受体菌，加入到一个无菌的250ml三角瓶中混合，置37℃摇床上培养100分钟。

4、将上述接合菌液用生理盐水稀释10⁰、10^-1、10^-2倍。

5、各吸取0.1ml稀释液涂布在选择培养基[A]平板上，每一种稀释液涂布2个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂布在[A]上作对照，每种各2个平板。此后均于37℃条件下培养48小时。

6、第四天，1）观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状况；2）在与平皿相同大小的白纸上画100个小格，将圆片贴于选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A]平板上随机挑选100个菌落，对号点种在选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100个小格中；3）将所有平板置于37℃箱内培养48小时。

7、第六天，统计在各种选择平板上生长菌落的数目，记录于表1－1中。并绘制出基因顺序图。

表1－1　各选择培养基上生长的菌落数目统计

重复次数	[B] arg	[C] trp	[D] his	[E] lac	[F] gal	[G] rif
1
2
3
4
5
6
总数
平均数
重组率*

表1－2　选择性培养基附加成份表

培养基 编号	选择性 标记	基本 碳源	基本培养基（A）中补充物质
			str	rif	arg	ilv	met	leu	ade	trp	his
A	Met leu str	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
B	(met leu str)arg	葡萄糖	＋	－	－	＋	－	－	＋	＋	＋
C	(met leu str)trp	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	－	＋
D	(met leu str)his	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	－
E	(met leu str)lac	乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
F	(met leu str)gal	半乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
G	(met leu str)rif	葡萄糖	＋	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋

实验二　　转座子插入引起的基因突变

一、原理

转座子（Tn）是能在不同复制子之间转移位置的核苷酸顺序。它一般来自抗药性质粒，由一个或几个抗药性基因加上两端两个顺序相同（但是方向不一定相同）的核苷酸片段（称为插入顺序IS）构成。当一个转座子转移位置而插入某一基因时，能使这一基因失活，即发生突变。各个转座子的抗药性基因、转移频率、插入位置、插入顺序都可以不同。有些转座子对于染色体的各个位置插入没有偏向，而另一些则偏向于插入某些特定的位置。

转座子的插入突变有两上表型效应，即基因突变的表型效应和由转座子带来的抗药性。因此利用转座子可以有效地取得任何一种突变型。一个很有效的方法是通过转座子诱发F’因子上的染色体基因的插入突变。

大肠杆菌2－2菌株的染色体上携带有Tn5转座子（含kan抗性基因）。要使Tn5插入到F’ Lac⁺Pro⁺/Str^s的乳糖发酵基因中去以引起Lac⁺突变，可先将这一F’因子转移到Δ(Lac Pro)Str^r受体细胞中去，再观察是否发生了插入突变。在能排除供体的含链霉素的培养基上选择Pro⁺受体菌落，若是抗卡那霉素的，那就是说受体细菌不但接受了F’因子，而且这一F’因子带有Tn5，如果它又由Lac⁺⁺变为Lac^-,不能在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，那么，这一插入位置就是在乳糖发酵基因中。

为进一步提高效率，还可以采取一种措施，使在特定条件下Lac⁺细菌不能生存而Lac^-细菌能够生存。已经知道galE突变型在有乳糖和半乳糖存在的情况下，由于细胞中积累有毒的半乳糖代谢中间产物UDP－gal和gal-1-P而死亡，所以如果采用galE突变型作为受体细菌，在含有0.02%乳糖和0.2%甘油的基本基上，受体细菌如果接受了一个F’Lac⁺Pro⁺，就不能生存。如果lac⁺基因由于插入了Tn5而成为lac⁺,那么受体细菌便能生存下来。

二、材料、试剂、器具

1、受体菌：F^-/Δ(lac proB) gaE str^r

2、供体菌：F’lac⁺pro⁺/Δ(lac pro)nal^r带Tn5于染色体某处。

3、LB完全培养液，每组4支，每支5ml。

4、无菌生理盐水，每组6支，每支4.5ml。

5、L选择培养基：含链霉素、卡那霉素、乳糖和甘油的基本培养基，每组6皿。

6、G选择培养基：含链霉素和葡萄糖的基本培养基，每组5皿。

三、步骤

1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和一环受体菌于两支5ml LB培养液中，37℃摇床上培养过夜。

2、第二天，取两个内含4ml　LB培养液的250ml三角瓶，分别加入1ml过夜培养的供体菌及受体菌，在37℃摇床上培养2-3小时。

3、将新鲜培养的供体菌及受体菌各取1ml，在一无菌的250ml三角瓶中混合，37℃轻摇60分钟。

4、吸取0.5ml混合菌液，用生理盐水稀释10^-6倍。

5、从10^-1倍稀释液中吸取0.1ml涂于L选择培养基平板上，将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂于L培养基上作为对照。再从10^-2、10^-3、10^-6倍稀释液中各吸0.1ml分别涂于G培养基平板上。37℃培育二天。

6、观察、统计并计算：

1）接受了供体F’(Lac⁺Pro⁺)的受体菌的数目：G板上生长的菌落数(个/ml)。

2)在L板上生长的菌落数（个/ml），即Tn5插入到lac基因上菌落数。

3）计算Tn5转座到lac Z或lacY上的转座频率，在L板上生长的菌落数/在G板上生长的菌落数。

实验三　　P1噬菌体介导的普遍性转导

一、原理

大肠杆菌可以利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。由类似噬菌体P1和P2介导的转导，能够转移供体染色体上任何一个基因，称为普遍性转导；由λ噬菌体等为媒介的转导，只能转导半乳糖发酵基因等少数基因，称为局限性转导。

P1噬菌体的DNA分子量为5.8×10⁷D，大约相当于大肠杆菌染色体的2％。在转导过程中，它的外壳中几乎只包装着寄主菌的染色体片断。假如大肠杆菌染色体的全长是100分钟，则P噬菌体外壳中包装的DNA片段最多可以带有相隔两分钟范围内的寄主基因。可以想象，包装时寄主染色体的断裂是随机的，两个基因相隔愈近，共转导的机率愈高。如果两个基因密切连锁，共转导的频率将接近1；相距很远，其共转导频率就接近或等于0。共转导频率（X）＝(1-d/L)³,d为以分钟计算的转导DNA的长度。利用这种关系可以进行两个距离很近的基因的定位，也可用来进行基因精细结构分析。位置非常接近的一系列拟等位突变位点也可以通过其转导测得它们的排列顺序。

由于转导的频率一般很低，大约每个感染细胞只有10^-4－10^-5。因此常用的方法是选取某一选择性标记的转导子，然后测定另一基因的出现频率，根据公式计算，确定它们之间的连锁关系。

二、目的

了解大肠杆菌普遍性转导的现象、原理和普遍性转导在细菌基因精确定位中的作用，掌握普遍性转导和基因定位的基本方法。

三、材料

1、受体菌：CSH1F- trp lacZ thi strA

2、供体菌：FD1009Hfr sup tsx。

3、噬菌体P1 cml, clr1000裂解液(10⁹ml)

4、噬菌体T6裂解液

5、生理盐水稀释管(4.5ml／支)

6、0.1mol/L CaCl₂

7、LB液体(5ml/支)、半固体(3ml/支)和固体培养基

8、氯仿

9、乳糖色氨酸基本培养基、葡萄糖基本培养基、葡萄糖色氨酸基本培养基

10、培养皿、三角瓶、试管、离心机、灭菌牙签、吸管、接种环、酒精灯。

四、实验步骤

（一）Pl cml, clr100裂解液的制备

1、第一天，接种供体菌株于LB液体培养基中，30℃培养过夜。

2、第二天，将供体菌液用LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养2小时。然后吸取0.2ml供体菌和0.1ml、10^-2的噬菌体原液（滴定度为10⁹/ml左右，细菌和噬菌体数目比大约为20：1）与3ml半固体LB培养基混匀后，倒在LB固体培养基上，凝固后37℃培养过夜。每组做3－4皿。其中有一皿不加噬菌体作为对照。

3、第三天，当噬菌体充分增殖后，将平板表面的半固体培养基转移到无菌的三角瓶中，加入5－10ml LB液体培养基和几滴氯仿，剧烈振荡20秒后离心(3000rpm, 10分钟)，上清液即为P1 cml, clr100裂解液。

4、将上清液移到无菌试管中，加入几滴氯仿，再次剧烈振荡20秒，于4℃保存。

(二)P1 cml，clr100裂解液效价测定

1、第三天，将30℃培养过夜的供体菌用10ml　LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养3小时。

2、分别吸取0.2ml新鲜培养物加入10支干净无菌的试管中，编号。

3、将待测噬菌体裂解液用LB培养液按1：10进行梯度稀释。

4、从每个稀释液中吸取20ul分别加入含供体菌的试管中，混匀。

5、于每支试管中加入3ml预平衡在50℃的LB半固体培养基，迅速摇匀后倒在LB固体培养基上，固化后37℃培养过夜。每组十一皿，其中一皿不加噬菌体作为对照。

6、第四天，统计不同浓度噬菌体裂解液的噬菌斑数，记录结果。计算P1噬菌体的效价，即每毫升噬菌体原液中P1噬菌体的数目（表3－1）。

（三）转导

1、第三天傍晚，接种受体菌株（CSH1）于5ml　LB液体培养基中，30℃培养过夜。

2、第四天，将过夜培养的受体菌用LB培养液按1：5稀释，37℃培养2－3小时。

3、在培养液中加无菌的CaCl₂溶液（终浓度为5×10^-3mol/L）。

4、取滴定度约为10¹⁰/ml左右的噬菌体裂解液，稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3倍。

5、取噬菌体稀释液与受体菌各1ml，加入一干净无菌的试管中混合。作为对照，其中一组应只加裂解液不加受体菌。

6、37℃保温20分钟，取出后离心15分钟，3500rpm。弃去上清液，加入1ml无菌生理盐水重悬菌体。

7、取100ul转导液涂布于乳糖色氨酸基本培养基（2皿）和葡萄糖基本培养基（1皿），37℃培养。以未经噬菌体处理的受体菌作对照，各涂1皿。同时将对照菌作梯度稀释，取10^-5及10^-6的稀释液分别涂布在色氨酸葡萄糖基本培养基上进行活菌计数。

8、第六天，观察统计菌落生长情况，计算转导频率（表3－2）。

（四）共转导测定

1、第六天，取0.1ml滴定度为10⁹－10¹⁰pfu的T6噬菌体裂解液涂布在LB完全固体培养上（2皿），室温下待裂解液吸干。

2、用灭菌牙签挑取100－200个在乳糖色氨酸基本培养基上长出的单菌落，点种在上述涂布T6噬菌体的培养基上，37℃培养。

3、第七天，计数长出的菌落（表3－3），计算共转导率。

五、实验结果

1、P1噬菌体的效价测定

表3－1　不同稀释平板上出现的噬菌斑数

裂解液稀释度	10^0	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8	10^-9	对照
第一组
第二组
…
平均数
噬菌斑数/ml

2、色氨酸和乳糖发酵基因的转导频率

表3-2 不同培养基上转导子数量统计

培养基类型	转导标记	转导子 数目/板	转导子 数目/ml	受体菌 数目/ml	转导频率*
[-]加葡萄糖	Trp
[-]加乳糖+trp	乳糖
[-]加葡萄糖+trp	活菌计数

3、计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的共转导频率，并计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的图距。

表3－3　共转导选择测定结果

组别	点种菌落数 (a)	[+]+T6培养皿上 长出的菌落数(b)	共转导频率* (X)
一
二
三
…
平均数

*共转导频率X=(b÷a)×100%

d=L(1-X^1/3)

实验四　　l噬菌体介导的局限性转导

一、原理

大肠杆菌l噬菌体的DNA，既可以自主存在于宿主菌中，也可以整合在细菌染色体中，完成溶源化过程。多数温和噬菌体整合进细菌染色体中时都有一特定的位置。大肠杆菌l噬菌体的原噬菌体附着在寄主染色体半乳糖操纵子基因gal和生物素合成基因bio之间，这一附着位置表示为BOB’，而λ噬菌体的附着位点表示POP’。BOB’和POP’都有相同的“核心序列”区，由15个核苷酸组成，噬菌体DNA和细菌DNA就是通过O区的单交换而发生整合，形成溶源菌。当溶源菌中的原噬菌体l被诱导出来时，大约10⁶个l噬菌体中有一个被反常切除，而携带半乳糖或生物素基因脱离寄主染色体。这种噬菌体除了带有染色体上半乳糖基因之外，还带有一部分噬菌体自身的染色体，因而被称为缺陷型半乳糖转导噬菌体(l defective galactose)，记为ldg。如果lDNA携带的是bio，则为ldb噬菌体。由ldg噬菌体转导即是一种局限性转导，转导子大部分是一种不稳定的gal^-/gal⁺(l)局部二倍体或被称为不稳定的杂合因子。

二、目的

了解大肠杆菌l噬菌体局限性转导的现象，掌握研究局限性转导的基本原理和方法。

三、材料、试剂和器具

1、溶源菌：E. coli K12(l)gal⁺(染色体半乳糖基因旁整合含有l原噬菌体)。

2、受体菌：E. coli K12 Sgal^-（为染色体上半乳糖基因缺陷型）

3、LB液体培养基、固体培养，2×LB液体培养基，0.8%半固体琼脂、半乳糖EMB培养基。

4、磷酸缓冲液(pH 7.0)。

5、氯仿。

6、培养皿、三角瓶、试管、离心管、吸管、玻璃涂棒。

四、操作步骤

（一）l噬菌体的诱导和裂解液的制备

1、第一天，取一环溶源菌接种于盛有5ml　LB的三角瓶内，置37℃培养16小时。

2、第二天，取培养后的菌液0.5ml加入盛有4.5ml LB的三角瓶内，继续在37℃培养4－6小时。

3、将以上培养后的菌液移入离心管中，3500rpm离心10分钟，弃上清液，加入4ml磷酸缓冲液悬浮。

4、取上述菌悬液3ml加在灭过菌的培养皿中，紫外线照射10－15秒钟（15W，距离40cm），使噬菌体由整合态转变为游离态。

5、加入3ml　2×LB液体培养基，37℃避光培养2－3小时。

6、将避光培养后的菌液移入离心管中，3500rpm离心10分钟，将上清液转入另一无菌的离心管中。

7、在上清液中再加入0.2ml氯仿（约4－5滴），剧烈振荡半分钟，静置5分钟。

8、将上清液转入另一无菌试管，4℃保存备用。

（二）l噬菌体裂解液效价测定

1、第一天，取一环受体菌接种于盛有5ml　LB液体培养基的三角瓶内，37℃培养16小时。

2、第二天，取0.5ml过夜培养的菌液，加入盛有4.5ml LB培养液的三角瓶内、37℃继续培养4小时。剩余的菌液留待转导试验用。

3、把l噬菌体裂解液用LB液体培养基作10倍递增稀释至10^-7。

4、取受体菌和裂解液（10^-6及10^-7）各0.5ml，分别加在LB固体培养基平板上。立刻加入3ml预平衡（50℃）的0.8%琼脂，迅速摇匀，铺平。凝固后置37℃培养24小时。

5、统计出现的噬菌斑数，计算l噬菌体裂解液的效价。

（三）转导

1、第一天，取6个半乳糖EMB培养基平板，其中2个皿仅加0.1ml裂解液（作为噬菌体对照），2个皿中仅加0.1ml过夜培养的受体菌（K12Sgal^-），作为受体菌的对照。剩余2个皿加噬菌体裂解液和受体菌液各0.05ml（若受体菌浓度较高可适当稀释）。

2、6个EMB培养基平板用灭菌玻璃棒涂布后，置37℃培养48小时。为防止交叉污染，每类平皿用一支涂棒。

3、第三天：观察并记录结果。

五、实验结果

1、统计每个平板上的噬菌斑数，计算裂解液的效价。

	10^-6	10^-7
第一组
第二组
…
平均数
噬菌斑数/ml

2、统计涂布法转导结果，计算转导频率。

	裂解液＋受体菌 A		受体菌对照 b		裂解液对照 c
	1	2	3	4	5	6
第一组
第二组
第三组
…
平均数
转导率*

*转导频率＝

实验五　　大肠杆菌质粒消除

一、原理

吖啶橙（AO）、溴化乙锭（EB）、十二烷基磺酸钠（SDS）等化合物在一定的浓度范围内能够选择性地抑制质粒复制。当带质粒的大肠杆菌在含上述抑制剂的培养基中生长时，由于质粒的复制被抑制，而染色体的复制和细胞分裂不受影响，所以在繁殖若干代以后，一部分细菌中的质粒便会丢失。培养的时间越长，细胞分裂的次数越多，丢失质粒的细菌所占的比例越高。最后通过选择性培养，即可得到没有质粒的大肠杆菌。

本实验使用的菌株的基因型为F’ lac⁺ pro⁺/nal^rΔ(lac proB)，通常情况下由于互补作用，该菌株可以在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，当失去了F’质粒（因子）后，它的基因型变为F^-/nal^rΔ(lac proB),即不能在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，并且需要Pro，借此可以分离出不含或含有F’质粒的细菌。本实验采用AO作为消除剂。由于不同菌株对AO的敏感程度不同，所以应先在含不同浓度AO的培养液中进行培养，最后采用AO浓度最高而大肠杆菌的生长又未被影响的培养物涂平板进行鉴定。这个实验成败的关键是，AO处理时培养液的pH一定要合适，AO浓度要适当，接种的细菌数要适当，一般控制在200－1000个/ml培养基。

二、目的

了解质粒的生物学特性，掌握质粒消除的基本原理和方法。

三、材料、试剂、仪器与用具

1、菌株：2－2F’(lac proB)/Δ(lac proB)nal^r。

2、LB完全培养液：每组11支，5ml/支，pH 7.6。

3、0.85%的灭菌生理盐水：每组17支，4.5ml／支。

4、AO原液（1mg/ml）：100mg　AO溶于10ml蒸馏水中高压灭菌。

5、LB完全固体培养基：每组8皿。

6、含乳糖和脯氨酸的基本固体培养基：每组4皿。

7、含葡萄糖和脯氨酸的基本固体基：每组4皿。

8、仪器与用品：恒温摇床，培养箱，高压灭菌锅，灭菌牙签。

四、操作步骤

1、第一天傍晚，将上述菌株接种于5ml LB培养液中(pH 7.0)，37℃恒温摇床上（200 rmp）培养过夜。

2、第二天，将上述过夜培养物用生理盐水稀释到10^-5，然后分别吸取0.1ml 10^-5倍的稀释液加入到含不同浓度AO（0、20、40、60、80、100mg/ml）的LB完全培养液(pH 7.6)中，37℃恒温摇床上（200　rpm）培养过夜。

3、第三天，将在不含AO和含最高浓度AO的培养液中生长的大肠杆菌分别用生理盐水稀释至10^-5和10^-6倍，各吸取0.1ml涂布在完全固体培养基上，每组各做3－4皿。然后在37℃培养箱内（底部朝上）培养过夜。

4、第四天，用灭菌牙签从上述培养基上挑取80个菌落，分别点种于以乳糖为唯一碳源和以葡萄糖为唯一碳源并含有脯氨酸的基本培养基上，37℃培养箱内培养过夜。

5、第五天，观察并记录结果，比较它们的消除率。

五、结果记录

AO浓度 (mg/ml)

含乳糖的平板上 生长的菌落数(a)

含葡萄糖的平板上 生长的菌落数(b)

消除率 (b-a)/b

实验六　　大肠杆菌质粒DNA快速制备与纯化

一、原理

质粒DNA的提取有多种方法，目前常用的有碱变性法、煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法、酸酚法、两相法、氯化铯－溴化乙锭密度梯度离心法等。本实验采用碱裂解法，其原理是在pH高于12.6的情况下，染色体DNA的氢键断裂，导致双螺旋结构解开而变性，而闭环的质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，变性的染色体DNA不能复性，而质粒DNA能迅速恢复到原来的构型。

当用碱性SDS裂解细菌时，SDS使细菌蛋白发生变性而沉淀，NaOH使染色体和质粒DNA变性。经醋酸钾中和后，环状质粒DNA很快复性，保存于溶液中；而大多数变性的染色体DNA不能再复性，通过离心随细胞碎片、蛋白质－SDS钾盐复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。上清液中的质粒DNA、RNA可通过乙醇沉淀而收集。再通过RNA酶处理即可得到纯化的DNA。这种纯化的DNA可以用限制性内切酶快速分析，观察电泳结果，与载体和供体的DNA酶切图谱比较，如有对应的片段，则说明重组质粒转化成功。

二、目的

了解质粒DNA的分子特征，掌握提取质粒DNA的基本原理和方法。

三、材料、试剂及用品

1、大肠杆菌HB101，DH5等其他转化菌珠。

2、含有适当抗生素的LB增养基。

3、GTE液：50mM葡萄糖，25mM　Tris-HC1(pH 8.0),10mM　EDTA。

4、TE缓冲液。

5、SDS/NaOH溶液：0.2N NaOH, 1%(W/V) SDS,使用前配制。

6、5M醋酸钾溶液(pH 4.8)。

7、95％和70％乙醇。

8、饱和酚。

9、饱和酚氯仿混合物（饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1）。

10、无菌双蒸水。

11、0.5M EDTA (pH 8.0) 溶液。

12、10mg/ml无DNA酶的RNA酶。

13、微量离心管、微量样器、恒温水浴、电泳仪、水平电泳槽。

四、实验步骤

1、在5ml LB培养液中接种一个单菌落，37℃振荡过夜培养。

2、转入1.5ml离心管中，14000rpm，离心5分钟。

3、吸去上清液，加入100ul　GTE溶液，室温放置5分钟，使细菌充分悬浮。

4、加入200ul SDS/NaOH溶液，迅速混匀，冰浴5分钟。

5、加入150ul 5M醋酸钾溶液，充分混匀，冰浴5分钟。

6、离心3分钟，使细菌碎片和染色体DNA沉淀。

7、转移上清液到另一个离管中，加2ul 10mg/ml RNA酶混合，37℃温育20分钟。

8、加入等体积的饱和酚混合，13000rpm离心2－3分钟。

9、将上相液转移到另一支离心管中，加等体积的氯仿混合，13000rpm离心2－3分钟。

10、吸取下相液，加入0.8ml 95%乙醇，室温放置2分钟，使核酸沉淀。

11、室温离心10分钟，沉淀质粒DNA。

12、弃上清液，用1ml　70％乙醇冲洗，离心弃去上相液。

13、真空干燥沉淀5－10分钟。加入30ul TE缓冲液，于－20℃保存备用。

14、限制性酶切反应（参见实验七）。

实验七　　DNA限制性内切酶酶切分析

一、原理

限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。把目的基因与切开的载体DNA混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。

进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。特定的酶有其配套的缓冲液。进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。

二、目的

了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。

三、材料、试剂与器具

1、DNA样品。

2、限制性内切酶。

3、10×限制性内切酶反应缓冲液。

4、无菌双蒸水。

5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。

6、10×TBE　buffer。

7、琼脂糖。

8、溴化乙锭溶液。

9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。

10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。

11、10mg/ml Rnase。

四、操作步骤

1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。

2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：

DNA样品 0.1-2mg

10×内切酶反应缓冲液 1ml

内切酶1 1ml

内切酶2 1ml

加无菌水至 10ml

3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。

4、在37℃温育60－120分钟。

5、加1／10体积0.5M的EDTA（pH 8.0）混合，终止反应。

6、与1／5体积的样品缓冲液混合。

7、琼脂糖凝胶电泳分析（见实验八）。

实验八　　DNA琼脂糖凝胶电泳分析

一、原理

琼脂糖凝胶具有分子筛效应。在中性pH值的电泳缓冲液体系中，DNA分子由于带负电荷，所以在电场作用下由负极向正极泳动。由于DNA分子的大小和构型不同，在相同的时间内迁移至不同的位置。凝胶经溴化乙锭染色后，紫外检测仪下观察，即可看见DNA片段按大小不同呈条带分布。由于在一定条件下，DNA的迁移率与分了量的对数值成反比，所以通过与已知分子量的标准DNA片段进行比较，即可知道未知DNA片段的大小。琼脂糖凝胶电泳分析还可用于DNA酶切分析、纯度鉴定、分离纯化、Southern杂交等。

二、目的

了解DNA琼脂糖凝胶电泳原理与用途，掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的基本操作方法。

三、材料、试剂和器材

1、DNA样品。

2、琼脂糖。

3、10×TBE缓冲液：0.9M　Tris-硼酸，0.02M EDTA(pH 8.0)。

4、溴化乙锭储备液：10mg/ml水溶液。

5、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40％（W/V）蔗糖水溶液。

6、标准DNA分子。

7、电泳槽、电泳仪、紫外检测仪、微量加样枪、石蜡膜。

四、操作步骤

1、琼脂糖凝胶液配制

称取1克琼脂糖，置于干净的三角瓶中，加入100ml 1×TBE缓冲液，在沸水浴或微波炉中加热，使之彻底融化。之后，加入5ul　EB储备液混合（终浓度0.5mg/ml），即制成1％的琼脂糖溶液。

2、凝胶板模具的准备

将电泳装置所配备的塑料盘两端的开口用胶布或透明胶带封住，或取一适当大小干净干燥的长方形玻璃板，用胶布或透明胶带封住边缘，作成槽状，水平地放在桌面上。在胶模的一端放上样品梳，距底板0.5-1mm，以便加入琼脂糖后形成完好的加样孔。

3、凝胶板的制备

将上述琼脂糖溶液放在室温下，待温度下降至60℃时，倒在凝胶板模具上，室温放置0.5-1小时。待琼脂糖彻底凝固后，轻轻拔出样品梳，撕去凝胶板模具两端（或四周）的胶带。

4、加样

将凝胶连同塑料盘或玻璃板一起放置到电泳槽中，加入1×TBE缓冲液，使缓冲液淹过凝胶表面约1mm。再于电泳缓冲液中加入一定量的EB储备液混匀（终浓度为0.5mg/ml）。用微量加样品吸取0.5-1mg DNA样品，按一定比例（体积/体积）加入上样缓冲液（上样缓液：DNA样品＝1：5）。混合后吸取10－20ml小心地加到凝胶板上的加样孔中。按同样的方法在附近的加样孔中加入已知分子量的标准DNA，作为参照。

5、电泳与观察

加样的一端接负极，另一端接正极。以5V/cm电压电泳2－3小时。当指示剂泳动到距凝胶前沿约1厘米的位置时，停止电泳。带上手套将凝胶板取出，直接置于紫外分析仪下观察和照相。在凝胶板上DNA按大小聚集成狭窄的谱带，并显示橙黄色荧光。通过与标准DNA比较即可估计待测DNA分子量的大小。

植物总DNA呈现一条迁移率很小的，整齐的谱带，质粒DNA呈现三条不同构型的条带。溴酚兰带前出现弥散荧光，说明DNA样品中存在RNA杂质。

实验九　质粒DNA形态的电子显微镜观察

一、原理

球状蛋白质一般都可以在低盐溶液或蒸馏水表面形成不溶解的变性薄膜，若浓度合适，则肽链伸展形成蛋白质单分子层。一般用碱性蛋白质包围带负电的核酸分子，当蛋白质展开时，核酸也随之展开，核酸的形态结构将保持一定的完整性。然后将核酸分子捞到支持膜上，经过负染色，就可以在电镜下观察。

二、目的

观察质粒DNA在电镜下的形态，掌握质粒DNA的电镜制样原理和方法。

三、材料、试剂和仪器

1、纯化的质粒DNA样品。

2、火棉胶。

3、醋酸异戊酯。

4、干净铜网。

5、真空喷镀仪。

6、醋酸铀水溶液。

7、铂铱合金。

8、展开储备液(0.1mg/L细胞色素C，1mol/L醋酸铵)。

9、滑石粉。

10、电子显微镜。

四、操作步骤

1、称取3克火棉胶溶解于100ml的醋酸异戊酯中，制成3％的溶液。

2、用滴管吸取该液，滴1－2滴于清洁的水面上，当醋酸异戊酯挥发后，在水面上形成一层均匀的火棉胶膜。

3、用镊子小心地将干净的铜网间隔一定距离排列在膜上。

4、在这些铜网上轻轻覆盖一张适当大小的滤纸，待滤纸湿润后将滤纸连同铜网、火棉胶膜轻轻捞起，铜网向上放于一干净培养皿中晾干备用。

5、将核酸样品（浓度为5mg/ml-10mg/ml）加到展开溶液中，终浓度为1mg/ml-0.5mg/ml，作为上相液。

6、将重蒸水注入干净的培养皿中，作为下相液。

7、将干净的载玻片斜放在培养皿中，在水表面撒少量滑石粉，以指示单分子膜的展开情况。

8、取50ul左右的上相液，在离下相液表面1cm处轻轻滴到斜面上，使上相液缓缓触及下相液表面并形成一层单分子膜。

9、用镊子夹着铜网，膜面朝下，轻轻沾取下相液表面的核酸分子。用滤纸吸去多余的液体，晾干备用。

10、用醋酸双氧铀染色15分钟，蒸馏水洗3次，每次10分钟，晾干备用。

11、在真空喷镀仪中用铂铱合金投影，以进一步增加电子反差。

12、电镜观察。

实验十　大肠杆菌的遗传转化

一、实验原理

大肠杆菌细胞在对数生长的早中期，经一定浓度的CaCl₂处理后，缓冲液中的质粒DNA较易进入该细胞，适当的加热可加速此过程（42℃－43.5℃），这种特殊的细菌生理状态，被称为感受态。外源DNA进入感受态细胞后，可在其中复制与表达。已摄入质粒DNA的细菌可在含有适当抗生素的培养基上生长，而不含质粒的细菌则不能在上面生长。本实验所用的POK12载体质粒携带有Kan抗性基因，所以在培养基中加上Kan就可以筛选转化子。

二、目的

了解大肠杆菌遗传转化的意义和用途，掌握利用质粒DNA转化感受态大肠杆菌细胞的方法。

三、材料、试剂及用具

1、受体菌：大肠杆菌DH5α。

2、LB液体基本培养基。

3、无菌CaCl₂溶液(100mM)。

4、无菌水。

5、水浴锅、冰块。

6、含Kan 20mg/ml的LB固体培养基。

7、SOC培养液。

四、实验步骤

（一）感受态细胞制备

1、第一天傍晚，接处受体菌于50ml LB培养液中，37℃振荡（250rpm）培养过夜。

2、第二天，于4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、加入1／10体积（5ml）的冰冷的100mM　CaCl₂溶液，悬浮，冰上放置30分钟。

4、4℃3000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、加1／10体积(0.5ml)冰冷的100mM　CaCl₂重新悬浮。

（二）转化

1、取三个干净无菌微量离心管，编号。按次序加入下列成分混合。

	1#	2#(对照)	3#(对照)
质粒DNA 感受态细菌	2ul(约1mg) 100ml	2ul(约1mg) －	－ 100ml

2、冰上放置30分钟。

3、42℃水浴中30秒。

4、加0.8ml SOC培养液，37℃振动培养60分钟，让抗生素抗性基因得到表达。

5、各取100ml培养物，分别均匀涂布在含25mg/ml Kan的LB固体培养基上。

6、室温下放置15分钟，将平板倒置于37℃培养箱内，培养过夜。

7、观察细菌的生长情况，统计并计算转化率。

实验十一　l噬菌体感染与裂解液制备

一、原理

l噬菌体是一种温和性噬菌体，可以进行裂解性和溶源性生长。当噬菌体感染宿主菌时，它的DNA注入宿主菌细胞，外壳蛋白留在外面，在进行裂解性生长时，它的基因组在宿主细胞内经过复制和重新包装后形成新的噬菌体颗粒，并使宿主细胞裂解；在进行溶源性生长时，它的DNA整合到宿主菌的染色体DNA上，并与宿主菌染体DNA一起复制，当染色体DNA受到损伤时，噬菌体DNA便从染色体DNA中分离出来，进行裂解性生长。

二、试剂和用品

1、5ml LB液体培养基一支，内含0.2%麦芽糖10mM硫酸镁。

2、软琼脂糖培养基。

3、LB琼脂固体平板培养基，每组3皿。

4、l噬菌体悬浮液（SM）。

5、20％麦芽糖贮备液（过滤除菌，4℃冰箱内保存）。

6、1M硫酸镁贮备液。

7、氯仿。

8、无菌带盖的玻璃试管（15mm×100mm），每组3支。

9、无菌吸管，恒温水浴锅、离心机、微量取样器。

三、实验步骤

1、取5ml LB培养液一支，加20％麦芽糖和1M硫酸镁各50ul。接种一环l噬菌体敏感的大肠杆菌，于30℃摇床（250rpm）上培养5－6小时，当OD₆₀₀为1.0－1.5时于4℃条件下保存备用（一周内有效）。

2、将配制的软琼脂糖培养基在沸水浴中融化，然后于50℃恒温水浴中平衡3－4小时待用。将LB固体平板培养基置于37℃培养箱内平衡2－3小时备用。

3、转染：取三支干净无菌有盖的玻璃试管，作上标记，分别加入如下溶液，混合后在37℃摇床(250rpm)上培养30分钟。

	试　管　编　号
组分	1#	2#	3#
受体菌(ul)	100	100	0
l噬菌体贮备液(ul)	50	0	50
无菌水(ul)	0	50	100

4、于每一试管中加入3－4ml预平衡到37℃的软琼脂培养液，迅速混合，均匀地倒在预平衡的LB固体平板培养基上。

5、室温下放置10分钟，然后倒置在37℃培养箱内培养过夜。次日观察，可以看到长满菌苔的平板上出现透亮的噬菌斑。

6、加入15ml噬菌体悬浮液，室温下振摇2小时。

7、收集裂解液于无菌离心管中，加入2－3滴氯仿混合，于4℃条件下保存。使用前离心，取用上清液。

实验十二　　l噬菌体效价的测定

一、原理

噬菌体效价（Plague forming unit/ml），是指单位体积(ml)噬菌体裂解液感染宿主菌后所形成的噬菌斑的数目。这是衡量噬菌体活力的重要指标。在提取DNA过程中，lDNA的产量取决于噬菌体的产量，而噬菌体的产量在其它条件相对恒定的情况下又取决于感染初期噬菌体与宿主菌的比例。要得到最佳实验结果就必须对噬菌体的效价进行测定。把噬菌体原液作适当稀释并与一定量的宿主菌混合感染，然后加入3ml融化的软琼脂培养基，混合后铺在LB固体平板培养基上并于37℃条件下培养过夜。根据每一个平板上形成的噬菌斑的数目、稀释液的体积和稀释倍数可得出被测噬菌体的效价。

二、目的

了解测定l噬菌体效价的意义和用途，掌握l噬菌体效价测定的基本原理和方法。

三、材料、试剂

1、5mL　LB液体培养基一支，内含0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁。

2、软琼脂糖培养基。

3、LB固体平板培养基，每组3皿。

4、l噬菌体悬浮液（SM）。

5、20％麦芽糖贮备液（过滤除菌，4℃冰箱内保存）。

6、1M硫酸镁贮备液。

7、无菌带盖的玻璃试管（15mm×100）,每组3支。

四、操作步骤

1、按实验十一描述的方法制备噬菌体原液。

2、取5ml LB培养液一支，加20％麦芽糖和1M硫酸镁各50ul。接种一环l噬菌体敏感的大肠杆菌，于30℃摇床（250rpm）上培养5－6小时,当OD₆₀₀为1.0－1.5时于4℃条件下保存备用。

3、将配制的软琼脂糖培养基在沸水浴中融化，然后于50℃恒温水浴中平衡3－4小时待用。将LB固体平板培养基置于37℃培养箱内平衡2－3小时备用。

4、取六支干净无菌的微量离心管编号，加入0.9ml LB培养液。

5、于1号管中加入0.1ml噬菌体原液混合，再从1号管中吸出0.1ml转到2号管中，依此类推，作10倍稀释，稀释至10^-6。

6、每组取三支干净无菌的试管编号，分别加入10^-4、10^-5、10^-6浓度的噬菌体稀释液各0.1ml，再于每管中加入0.1ml的噬菌体敏感菌培养物，混合。

7、37℃摇床上培养30分钟，250rpm。

8、分别于每管加入3ml预平衡到50℃的软琼脂培养液，混合后倒入LB固体平板培养基上。室温下静置10分钟使之凝固。

9、37℃培养过夜，观察并计数噬菌斑的数目。

10、按下列公式计算该噬菌体原液的效价：

实验十三　　l噬菌体DNA的分离与分析

一、原理

l噬菌体DNA作为一种基因工程载体，在组建动植物基因组DNA和cDNA文库方面具有重要用途。lDNA通常被包在一个蛋白质外壳中。蛋白质外壳经链霉蛋白酶（或蛋白酶K）和SDS处理后，发生解体和变性，最后可通过苯酚抽提和离心被去除。保留在水相中的DNA可经乙醇或异戊醇沉淀后离心收集。

二、目的

进一步了解l噬菌体的特性，掌握l噬菌体DNA的提取原理和分析方法。

三、试剂与用品

1、l噬菌体原液。

2、受体菌。

3、LB液体培养基（5ml/管，100ml／瓶）。

4、LB固体平板培养基。

5、1M　MgSO₄。

6、20％PEG　8000/2M NaCl。

7、SM溶液。

8、DNase(10mg/ml)。

9、RNase(10mg/ml)。

10、0.5M EDTA(pH 8.0)。

11、Proteinase K(10mg/ml)。

12、10％SDS。

13、3M醋酸钾。

14、TE缓冲液。

四、操作步骤

1、接种一个噬菌体敏感菌单菌落于5ml含0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁的LB培养液中，振荡培养5－6小时，至OD值为1.0-1.5。

2、预热50ml　LB培养液至37℃。

3、取一干净无菌带盖的玻璃试管，加入0.1ml受体菌和0.05ml噬菌体贮备液，37℃振荡培养30分钟。

4、将上述感染物转入预热的50ml　LB培养液中，再补加500ul　1M硫酸镁，并于摇床上培养过夜。

5、次日，加3ml氯仿，37℃振荡培养15分钟，使细菌裂解。

6、将培养物转入50ml无菌带盖的离心管中，8000rpm，离心20分钟。

7、将上清液分装到3个50ml　无菌带盖的离心管中（每管15ml）。每管加入15ml预冷的PEG/NaCl（一倍体积）混合后，在冰浴上放置60分钟。

8、4℃，9100rpm离心20分钟。

9、弃去上清液，在吸水纸上倒置数分钟。

10、用500ul SM液悬浮噬菌体，转入1.5ml 的Eppendorf管中。

11、加1ul　DNase和4ul　RNase，混合，37℃温育20分钟。

12、加50ul EDTA，混合后65℃水浴5分钟。

13、加2ul Proteinase K和25ul　10％SDS，混合后65℃水浴15分钟。

14、加入100ul　3M醋酸钾，冰浴上静置20分钟。

15、1200rpm离心15分钟，分相。

16、转上清液到新的Eppendorf管中，加600ul异丙醇, 轻轻颠倒2－3次，冰浴10分钟。

17、离心，13000rpm,10分钟。

18、弃上清液，加1ml　70％乙醇，冲洗，不必悬浮起来。

19、13000rpm离心10分钟，弃上清液。

20、空气干燥。

21、加50ul　TE　Buffer悬浮，4℃保存待用。

22、进行琼脂糖凝胶电泳，检测制备的样品（参见实验八）。

实验十四　　植物基因组DNA的快速提取与纯化

一、原理

DNA和RNA在真核生物体内都是以蛋白质复合物的形式存在的。动植物组织中的DNA－蛋白质复合物可溶于水或高盐溶液（1M的氯化钠），而微溶于0.14M的盐溶液中；RNA－蛋白质复合物则易溶于0.14M的盐溶液中。利用这一性质，通过离心可将DNA－蛋白质复合物与RNA－蛋白质复合物和其它杂质分开。通过氯仿、苯酚或SDS的变性处理，DNA－蛋白质复合物中的蛋白质被沉淀并经离心除去。保留在水相中的DNA通过乙醇或异戊醇沉淀可被回收。本实验方法简单快速，适用于各类植物，不需苯粉、氯仿等有害有机溶剂。结合PCR可用于田间杂种植株大范围的筛选研究。

二、目的

了解分离植物基因组DNA的原理和用途，掌握快速提取植物基因组DNA的基本方法。

三、材料、试剂和器具

1、不同品种的小麦幼苗。

2、样品提取液：20mM Tris-HCl(pH 7.5), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5%SDS。

3、TE　buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)。

4、异戊醇。

5、无菌水。

6、微量离心管、旋涡混合器、微量离心机。

四、实验步骤

1、取用植物幼嫩的叶片，无菌水冲洗，用吸水纸吸干表面的水分。

2、取一片叶片，放在微量离心管管口，盖上盖子，夹取与管盖大小相等的叶盘于管内。

3、用一圆头玻棒在管内研磨15分钟。

4、加入400ul样品提取液，盖紧盖子，在旋涡混合器上混合5秒钟，室温下抽提10－60分钟，间歇摇动。

5、13000 rpm离心10分钟。

6、将上清液（约300ul）转移到另一干净的离心管中。

7、加入等体积的异戊醇与之混合，室温下放置10分钟。

8、13000rpm离心10分钟，倒掉上清液，加入1ml 70%的冷乙醇。

9、13000rpm离心10分钟，弃去上清液。

10、真空干燥20分钟。

11、加入100ul　TE缓冲液，溶解DNA，4℃条件下保存备用。

12、用紫外分光光度计（260nm和280nm）或琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

实验十五　　植物基因组DNA的RFLP多态性分析

一、原理

DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。RFLP多态性是指DNA限制性内切酶酶切片段长度的多态性(restniction fragment length olymophorphism)。由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之间，它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，经特定的限制性内切酶切割后，所产生的限制性酶切片段在大小（长度）和数目方面自然也存在着差异。通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异。电泳分离后，通过Southern杂交也可显示出已知DNA片段的差异。

二、目的

通过本实验了解不同植物或同一植物不同个体之间基因组DNA顺序的差异性，掌握DNA限制性酶切片段长度多态性研究的基本方法。

三、材料和试剂

1、从不同植物或同一植物不同个体分离出的基因组DNA。

2、限制性内切酶。

3、10×限制性内切酶缓冲液。

4、0.5M EDTA(pH 8.0)

5、溴化乙锭。

6、琼脂糖。

7、电泳仪和电泳槽。

四、操作步骤

（一）限制性内切酶酶切。

1、将在-20℃冷冻的DNA在冰上融化。

2、取8支微量离心管按下表所示作好标记，并依次加入所需成分。

	品种I		品种II		品种I－1		品种II－2
	单酶切 1#	双酶切 2#	单酶切 3#	双酶切 4#	单酶切 5#	双酶切 6#	单酶切 7#	双酶切 8#
DNA	10	10	10	10	10	10	10	10
10×缓冲液	2	2	2	2	2	2	2	2
Eco R I		1	1	1	1	1	1	1
Hind III		1		1		1		1
无菌水	7	6	7	6	7	6	7	6
总体积(ul)	20	20	20	20	20	20	20	20

3、混匀，慢速离心2秒，使溶液全部聚于管底。

4、37℃保温2－3小时。

5、加入1／10体积的0.5M EDTA溶液终止反应。

（二）琼脂糖凝胶电泳分析

参照实验八。

实验十六　　植物总RNA的快速提取与纯化

一、原理

RNA包括rRNA、tRNA和mRNA等，大部分通常是以核蛋白复合物的形式存在的。通过SDS、苯酚处理使蛋白质变性并沉淀。利用LiCl溶解双链DNA的特性去除DNA，经乙醇沉淀得到总RNA。纯度高、完整性好的RNA，即可用于Northern杂交、纯化mRNA、cDNA合成和体外翻译等进一步的实验。

提取RNA过程中预防RNase对RNA的降解至关重要。由于RNA酶也是蛋白质，所以使所有蛋白质迅速彻底地变性同时防止了RNase对RNA的降解。可通过二乙基焦碳酸盐DEPC）处理所使用的器皿、水以及部分溶液，并在提取体系中加入RNase抑制剂等来抑制内源、外源的RNase活性。

二、目的

了解提取植物总RNA的原理和意义，掌握快速制备植物总RNA的基本方法。

三、材料、试剂

1、幼嫩的植物叶片。

2、液态氮2L。

3、Tris-Cl平衡酚(pH 8.0)。

4、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合物。

5、氯仿。

6、3M　NaAc(pH 5.3)。

7、RNA提取缓冲液：0.2M Tris-HCl(H 9.0), 0.4M LiCl, 25mM EDTA, 1%SDS。

8、2M　LiCl。

9、0.2M Tris-HCl, pH 9.0。

10、0.4M LiCl。

11、95％乙醇。

12、75％乙醇。

13、瓷研钵。

14、无RNase的重蒸水。

四、操作方法

1、称取植物材料0.1g。

2、在瓷研钵中倒上液氮，将材料剪成小块放入液氮中，待液氮稍少时充分研磨材料，中间可补充少许液氮。

3、将粉末刮入1.5ml离心管，加入0.55ml提取液剧裂振摇2－3分钟。

4、加入0.55ml苯酚－氯仿－异戊醇混合液，振摇1分。

5、13000rpm离心10分钟。

6、将水相转到一个新的离心管中，重复第4－5步2次。

7、将水相转至新的离心管中，加入0.55ml氯仿振摇混匀，以除去痕量的苯酚。

8、13000rpm离心3－5分钟。

9、将水相转移至新离心管中，加55ul　3M　NaAc(H 5.3)和2倍体积的95％乙醇。-20℃下静置20分钟。

10、4℃条件下13000rpm离心15分，用移液枪吸去上清液。

11、加0.3ml2MliCl，用移液枪轻轻吹打使双链的DNA溶解，冰浴上静置10－30分钟。13000rpm离心15分钟，弃去上清液。

12、加0.3ml无RNase的重蒸水，振摇使沉淀溶解。

13、加30ul3M　NaAc(pH5.3)和0.7ml 95%乙醇，混匀。－20℃冰箱内放置20分钟，13000rpm离心15分钟。

14、弃去上清液，加入0.5ml　75%乙醇，13000rpm离心5分钟。

15、小心吸去上清液，真空干燥10分钟。

16加入50nl无RNase重蒸水重悬RNA，然后置于－20℃保存。

17、用紫外分光光度计则定260nm和280nm处的光密度。对纯的RNA来说。OD₂₆₀／OD₂₈₀为2.0，1OD₂₆₀约为40mg/mlRNA。

18、RNA琼脂糖变性胶分析（见实验十七）。

实验十七　RNA琼脂糖变性胶电泳分析

一、原理

RNA分子是以单链形式存在的，但在局部仍有双链结构形成。由于这种局部双链结构的干扰，使得在非变性凝胶上对RNA分子完整性的鉴定及其分子量大小的检测，变得不十分可靠。通过加入乙二醛一二甲基亚砜、氢氧化甲基汞、甲醛等变性剂进行变性处理，使其局部双链变为单链。再进行电泳，RNA的泳动距离与其片段大小的对数值就形成良好的线性关系，从而可对RNA的分子大小及完整性程度作准确的分析。

二、目的

了解琼脂糖变性胶电泳的原理和用途，掌握利用变性凝胶分析RNA的基本方法。

三、材料、试剂和仪器

1、已制备的植物RNA或其他RNA样品。

2、10×MOPS：0.4M MOPS, 100mM 醋酸钠，10mMEDTA，pH　7.0。

3、电极缓冲液：1×MOPS。

4、甲醛。

5、去离子甲酰胺。

6、加样缓冲液：50％（W／V）甘油，1mM EDTA(pH 8.0), 0.25%(W/V)溴酚蓝，0.25%（W/V）二甲苯青。

7、分子量标准参照物。

8、琼脂糖。

9、无菌重蒸水。

10、水浴锅。

四、操作方法

（一）琼脂糖变性胶制备

1、将电泳槽、胶模及样品梳先在3％H₂O₂中浸泡10－30分钟，在后用无菌无RNase的双蒸水彻底冲洗，干燥备用。

2、取一个干净的250ml三角瓶，加入40ml无菌双蒸水和0.5g琼脂糖，在微波炉或沸水浴上加热使琼脂糖彻底融化。

3、待融化的琼脂糖冷却至60℃－70℃时，依次加入9ml甲醛、5ml　MOPS缓冲液和0.5ul溴化乙锭，轻轻摇动混合均匀。

4、将胶模两端的开口用胶带封好，水平放置在桌面上，在一端放上样品梳，梳齿高于底板0.5-1mm。

5、将凝胶溶液倒在胶模上，厚度3－5mm，室温放置30分钟，使胶完全固化。

6、撕去两端的胶带,　将胶模放在样品槽中。加入1×的MOPS电泳缓冲液，液面高出胶面1－2mm，从胶上小心拔出样品梳，检查样品孔是否完整。

（二）样品处理

1、取一个DEPC处理过的微量离心管，依次加入10×MOPS　2ul，甲醛3.5ul，去离子甲酰胺10ul，RNA样品4.5ul，混匀。

2、将离心管置于60℃水浴中保温10分钟，再在冰上静置2分钟。

3、加入3ul上样缓冲液，混匀。

（三）电泳

1、用20ul加样枪将上述样品加到样品孔内。同时加分子标准作为参照。

2、加样端接负极，另一端接正极。于7.5V/cm电压下电泳，当溴酚兰泳动至凝胶的3／4距离时，停止电泳。

3、紫外检测仪下观察和照相。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带，即28S、18S、和5S　rRNA。其中28S　rRNA条带的亮度应该为18S　rRNA条带的两倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S　rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。

实验十八　　植物酯酶同工酶基因的染色体定位

一、原理

酶和蛋白质是基因表达的产物，基因位于染色体上。当某一对同源染色体缺失时，位于这对染色体上的基因和它们所编码的酶或蛋白质也就随之丢失。以正常小麦及其缺体系为材料，通过蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和同工酶分析，即可确定编码这些酶或蛋白质的基因在基因组中的定位（位于哪对染色体上）。

酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，在细胞代谢过程中起重要作用。电泳分离后，凝胶中的酶催化底物a-或b－乙酸奈酯水解，水解产物与坚牢兰RR盐作用形成褐色或红色的复合物，借此可以鉴定酯酶同工酶的存在、数量和酶活性的大小。

二、目的

通过本实验，可以进一步了解染色体与基因、基因与酶蛋白的关系，加深对于酶是基因表达产物的认识。同时掌握利用缺体品系进行酯酶同工酶基因定位的方法。

三、材料、试剂

1、正常小麦及其缺体系萌发种子或幼苗。

2、Acr-Bis贮备液：30％Acr-0.8%Bis水溶液。

3、Tris-柠檬酸缓冲液(pH 6.8)：1.55g Tris, 0.1g柠檬酸，100ml。

4、Tris-柠檬酸缓冲液 (pH 8.9)：15.5g Tris, 1g柠檬酸，1000ml。

5、1.247%EDTA溶液。

6、15过硫酸胺。

7、TEMED。

8、样品提取缓冲液：0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 5% (W/V)蔗糖，0.1M 巯基乙醇。

9、10×电极缓冲液：6.2g Tris, 2g Gly, pH 8.7, 1000ml。

10、a-乙酸奈酯储备液：20mg/ml，溶于丙酮中。

11、坚牢兰RR盐储备液：20mg/ml，溶于丙酮中。

12、磷酸缓冲液：0.1M, pH6.4。

13、1％琼脂糖。

14、加样缓冲液：30％甘油，0.05%溴酚兰。

三、操作步骤

（一）凝胶模具的装配

1、将装配凝胶模具所用的玻璃板、橡胶框、样品梳等用具洗净，晾干。

2、将两块玻璃板固定于橡胶框上，用滴管吸取融化的琼脂糖封住底边。

3、琼脂糖凝固后，将玻璃板及橡胶框一边装在电泳槽上。

（二）凝胶的配制

1、取一个干净烧杯，按表中分离胶的组成依次加入相应的组分，混合。

2、将凝胶板模具稍倾斜，把分离胶溶液沿两块玻璃板上方缓慢倒入，注意防止产生气泡。当液面距顶端3cm时停止灌胶。

3、将胶模垂直放置，在胶液表面用注射器小心覆盖一层蒸馏水（约3mm），室温下聚合。水和胶液两相间出现界面时，表面聚合已经完成。

4、再取一个干净烧杯，按表中浓缩胶的组成配制浓缩胶，混合。

5、用注射器和滤纸吸去分离胶表面的水分，将浓缩胶缓缓倒在分离胶上部，当液面距玻璃板顶部3mm时，立即插入样品梳，室温下聚合。

表18－1　分离胶和浓缩胶的配方

	分离胶浓度		浓缩胶浓度
	7％	10％	3％	4％
30%Acr-0.8%Bis(ml)	4.5	6.5	1.0	1.3
Tris-柠檬酸pH8.9(ml)	14.2	12.2	…	…
Tris-柠檬酸pH6.8(ml)	…	…	1.0	1.3
1.247%EDTA(ml)	0.8	0.8	0.1	0.2
1%AP(ml)	0.5	0.5	0.3	0.3
TEMED(ul)	20