《普通遗传学》实验

 

实验一   果蝇实验技术

一、实验原理

果蝇（fruit fly）是双翅目（Diptera）昆虫，属果蝇属（genus Drosophila），约有2500个种。通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。用果蝇作为实验材料有许多优点：

1. 饲养容易。在常温下，以玉米粉等作饲料就可以生长，繁殖。

2. 生长迅速。十二天左右就可完成一个世代，每个受精的雌蝇可产卵400～500个，因此在短时间内就可获得大量的子代，便于遗传学分析。

3. 染色体数少。只有4对。

4. 唾腺染色体制作容易。横纹清晰，是细胞学观察的好材料。

5. 突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察。

果蝇的生活史：

果蝇的生活周期长短与温度有密切关系。一般来说，30℃以上温度能使果蝇不育或死亡，低温能使生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度为20～25℃。

生活周期长短与饲养温度的关系

 

10℃

15℃

20℃

25℃

卵→幼虫

幼虫→成虫

57天

18天

8天

6天

5天

4天

果蝇在25℃时，从卵到成蝇需10天左右，成虫可活26～33天。果蝇的生活史如下：

雌蝇 →减数分裂 → 卵

受精

雄蝇 →减数分裂 →精子            

 

第一批成虫

羽化（第八天）

（可活26～33天）                                                      产第一批卵

 

蛹（第四天）

 

第二次蜕皮                                                              第一批卵孵化

（第二天）                                                            （第零天）

 


第一次蜕皮                  幼虫

（第一天）

果蝇的生活周期和各发育阶段的经过时间

果蝇的性别及突变性状的鉴别：

果蝇的每一体细胞有8个染色体（2n=8），可配成4对，其中3对在雌雄果蝇中是一样的，称常染色体。另外一对称性染色体，在雌果蝇中是XX，在雄蝇中是XY。

果蝇的雌雄在幼虫期较难区别，但到了成虫期区别相当容易。雄性个体一般较雌性个体小，腹部环纹5条，腹尖色深，第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流苏，称性梳（Sex combs）。雌性环纹7条，腹尖色浅，无性梳。

实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。现列表如下：

实验中使用的果蝇突变品系

影响部分

突变名称

基因符号

染色体上座位

翅

眼色

体色

刚毛

翅形

残翅

白眼

黑体

焦刚毛

小翅

vg

w

b

sn

m

IIR 67.0

X 1.5

IIR 48.5

X 21.0

X 36.1

焦刚毛的基因座为sn3, 本文简写为sn。

二、实验材料

不同品系的黑腹果蝇。

三、培养基和培养瓶

1. 果蝇饲料的配制

果蝇是以酵母菌作为主要食料的，因此实验室内凡能发酵基质，都可用作果蝇饲料。常用的饲料有玉米饲料、米粉饲料、香蕉饲料等。配方如下表：

果蝇饲料的几种配方

 

玉米饲料

米粉饲料

香蕉饲料

水（毫升）

琼脂（克）

蔗糖（克）

香蕉浆（克）

玉米粉（克）

米粉（克）

麸皮（克）

酵母粉（克）

丙酸（毫升）

200

1.5

13

—

17

—

—

1.4

1

100

2

10

—

—

8

8

1.4

1

50

1.6

—

50

—

—

—

1.4

0.5—1

1）玉米饲料：

i)取应加水量的一半，加入琼脂，煮沸，使充分溶解，加糖，煮沸溶解。

ii)取另一半水混和玉米粉，加热，调成糊状。

iii)将上述两者混和，煮沸。以上操作都要搅拌，以免沉积物烧焦。

iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。按附表用量配制，可得饲料200毫升左右。

2）米粉饲料：方法与玉米饲料相同，用米粉代替玉米粉。

3）香蕉饲料：

i)将熟透的香蕉捣碎，制成香蕉浆。

ii)将琼脂加到水中煮沸，使充分溶解。

iii)将琼脂溶液加入香蕉浆，煮沸。

iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。

丙酸的作用是抑制霉菌污染，用量参照附表，每200毫升饲料约加1毫升左右。如无酵母粉，也可用酵母液代替，但用法不同。若用酵母菌液则在饲料分装到培养瓶中以后再加入，每瓶加数滴。

2.培养瓶

培养果蝇用的培养瓶可用牛奶瓶，或大、中型指管，用海棉或纱布包的棉花球作瓶塞。实验室中保存原种以及杂交实验以中指管为宜。培养瓶用前要消毒，而后再装饲料（每瓶2厘米厚即可），待饲料冷却后，用酒精棉花擦瓶的内壁，然后插入消毒过的吸水纸，作幼虫化蛹时的干燥场所。

四、实验药品和器具

1. 药品

（1）乙醚     （2）配制培养基所需药品(略)

2. 器具

（1）麻醉瓶  （2）镊子  （3）白瓷板  （4）毛笔  （5）吸水纸  （6）海绵垫  

（7）果蝇瓶（指管） （8）棉花  （9）解剖镜  （10）死蝇盛留器  （11）灭菌锅

五、实验步骤

1. 麻醉

对果蝇进行检查时，用乙醚麻醉，使果蝇处于昏迷状态。使用时将乙醚（2～3滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要让乙醚流进瓶内），麻醉瓶要保持干燥，否则会粘住果蝇翅膀，影响观察。麻醉果蝇时，先将长有果蝇的培养瓶在海棉垫上敲，使果蝇全部震落在培养瓶底部，然后迅速打开培养瓶的棉塞，把果蝇倒入去盖的麻醉瓶中，并立即盖好麻醉瓶，待果蝇全部昏迷后，倒在白瓷板上进行观察。

果蝇的麻醉程度看实验要求而定，对仍需培养的果蝇，以轻度麻醉为宜。但对不再培养，单单进行性状观察的果蝇可以深度麻醉，甚至致死也无妨（果蝇翅膀外展45°角，说明死亡）。检查完毕后，把不需要的果蝇倒入盛有煤油或酒精的瓶中（死蝇盛留器）。

2. 果蝇交配

将雌雄果蝇放在一起培养，雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子，足够它多次排出的卵受精，因此在做杂交试验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇）。雌蝇孵出后12小时内不会交配，这个时间内把果蝇全部倒出，分出雌雄蝇，单独饲养，这时收集的雌蝇是处女蝇。杂交时把所需品系的雄蝇直接放到处女蝇培养瓶中，贴好标签，注明两亲本的基因型及交配日期，进行培养。7～8天后倒掉亲本（一定要倒干净，以免亲代和子代混淆），待F1成蝇羽化后开始计算，观察性状。可靠的计数及观察是培养开始的20天以内（再晚上F2也可能有了）。若须继续实验，观察F2，可在F1内挑出雌雄数对，另外培养，因为这次是用F1作亲本，进行个体间互交，所以这时不是处女蝇也可以。但如要把F1雌蝇与另一品系雄蝇杂交时，还要严格地选取处女蝇，方法同上。

3. 原种培养

在作新的留种培养时，应事先检查一下果蝇有没有混杂，以防原种丢失。亲本的数目一般每瓶5～10对，移入新瓶时，须将培养瓶横卧，然后用毛笔将麻醉的果蝇从白瓷板上轻轻扫入，待果蝇醒过来后再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在饲料上。原种每2～4周换一次培养基（依温度而定，10～15℃约4周换一次，20～25℃约二周换一次）。每一原种培养至少保留两套，培养瓶的标签上要写明突变名称，培养日期等。作原种培养温度可控制在10～15℃，培养时避免日光直射。

果蝇在适宜条件下会产子代，在肉眼能看到幼虫时就可把亲本倒掉，几天以后，新的成蝇便产生。待成蝇有了足够保种的数量后，要调换培养瓶，作为下一代的亲本，继续培养。

原种果蝇培养遇到的麻烦是饲料发霉。发霉的原因很多，如用具没有灭菌，空气污染，亲本不及时倒掉……，都会引起饲料发霉。严重的霉菌污染会影响果蝇的生长。饲料中加丙酸可以抑制霉菌，但并不能完全制止。发现培养瓶中有少量霉点时可用烧过的解剖针挑出。若大量霉菌污染，可把果蝇全部倒在一个消毒过的空指管中，让它活动2～3小时，换一支指管，再活动1～2小时，而后倒入一支新的培养瓶中继续培养，这样可以防止霉菌污染。

原种保存遇到的另一个问题是混杂，几个不同品系的果蝇在一起培养，一定要防止混杂。培养瓶的塞子要做得紧些，不使果蝇逃出。调换培养瓶时，要防止果蝇飞散。外逃的果蝇要打死。发现了混杂的原种，要根据原种果蝇的全部特征，挑出数对雌雄蝇饲养，进行筛选直到完全没有分离为止。这样做，费时费力，只是在不得已时才采用。一般混杂时，只要方便，可以重新引种，将混杂种弃去。

 

 

 

实验二  果蝇杂交实验

1. 实验目的

通过实验验证分离规律，自由组合规律和连锁互换规律等遗传学的基本规律，掌握果蝇杂交的实验技术，了解普通果蝇的生活史及一些突变型的表现性状。在实验中熟练运用生物统计的方法对实验数据进行分析。

2. 实验原理

普通果蝇（Drosophila melanogaster）是双翅目的昆虫，它的生活史从受精卵开始，经历幼虫、蛹和成虫阶段，因此是一个完全变态的过程。果蝇中有许多突变类型，据不完全统计突变性状有四百多种，这些突变型大多属于形态突变，如白眼、残翅、黄体等，因此很容易进行观察。果蝇体型小，在培养瓶内易于人工饲养。而其繁殖力很强，在适宜的温度和营养条件下每只受精的雌蝇可产卵400个左右，每2个星期就可完成1个世代，因此在短时间内就可以获得大量的子代。此外，由于果蝇具有多线染色体以及生活史不同发育阶段的特点和基因组结构特点使其成为生物学研究中的模式生物，同时在遗传学研究中得到广泛而深入的研究。

本实验中教师提供给学生多种突变类型的果蝇，学生经过实验小组的讨论决定使用哪些类型和具体实验方案。因此整个实验过程是在完全开放状态下进行，实验过程中涉及到基因的显隐性、连锁、上位等多种关系，同时会得出一些与期望值不同的结果。要求学生在一段时间内安排好实验进程，如实记录实验中出现的现象和问题，并作出自己的分析和判断。

3. 实验用具及材料

双筒解剖镜、麻醉瓶、毛笔、白瓷板、普通果蝇野生型及不同突变型果蝇、乙醚、玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等。

4. 实验方法及步骤

1）普通果蝇的生活史及形态观察

（1）生活史观察

①卵  成熟的雌蝇交尾后（2～3d）将卵产在培养基的表层。用解剖针的针尖在果蝇培养瓶内沿着培养基表面挑取一点培养基将其置于载玻片上，然后滴上1滴清水，用解剖针将培养基展开后放在显微镜低倍镜下仔细进行观察。果蝇的卵为椭圆形，长约0.5mm，腹面稍扁平，前端伸出的触丝可使卵附着在培养基表层而不陷入深层。

②幼虫   果蝇的受精卵经过一天的发育即可孵化为幼儿虫。幼虫在培养基内及瓶壁上都有，培养基内的幼虫一般要小一些。这是因为果蝇的幼虫从一龄幼虫开始经两次蜕皮，形成二龄和三龄幼虫，随着发育而不断长大，三龄幼虫往往爬到瓶壁上来化蛹，其长度可达4～5mm。幼虫一端稍尖为头部，黑点处为口器。幼虫在培养基内和瓶壁上蠕动爬行。

③蛹   幼虫经过4～5d的发育开始化蛹。一般附着在瓶壁上，颜色淡黄。随着发育的继续，蛹的颜色逐渐加深，最后为深褐色。在瓶壁上看到的几乎透明的蛹是已经羽化完而遗留的蛹的空壳。

④成虫  刚羽化出的果蝇虫体较长，翅膀也没有完全展开，体表未完全几丁质化所以成半透明透乳白色。随着发育，身体颜色加深，体表完全几丁质化。羽化出的果蝇在8～12h后开始交配，成体果蝇在25℃条件下的寿命为37d。

2）雌雄鉴别

为了准确地配制果蝇的杂交组合和果蝇遗传性状分析，必须首先能够正确辨别果蝇的性别。

①麻醉  对果蝇实施麻醉是为了便于性状观察和转移果蝇，因此麻醉时一定要根据实验目的的而确定麻醉的深度。如果只是进行观察，可以将果蝇麻醉至死。死亡时表现为翅膀与身体呈45度角。但如果是麻醉鉴别后再进行转移培养，就应避免麻醉至死。麻醉时，在麻醉瓶的瓶盖内塞入沾有乙醚的棉花，待乙醚气体在瓶内充满后将果蝇培养瓶的瓶口与麻醉瓶口对准，将果蝇转入麻醉瓶内，盖好瓶盖。观察果蝇的表现，若果蝇从瓶壁上纷纷落到瓶底，表示麻醉已生效。转移麻醉后的果蝇时，应用毛笔的笔尖粘取。

②将麻醉后的果蝇放在解剖镜下仔细观察，区别雌雄的差异。

可以着重从以下几方面观察雌雄果蝇主要差异，见表4-1。

表4-1  雌雄果蝇主要差异比较

雌蝇

雄蝇

体型较大

腹部椭圆型末端稍尖

腹部背面5条黑纹

 

无性梳

体型较小

腹部末端钝圆

腹部背面3条黑纹

最后一条延伸至腹面成一黑斑

第一对足第一跗节有性梳

在雌雄差异中，以性梳的差异最为准确。如刚羽化出的果蝇（图4-3），身体都较和长，颜色很浅。但是，用性梳的有无就可以很快将雌雄分开，在熟练操作几次后，就可以不必借助解剖镜也能很快区分雌雄。在观察性梳时可以用解剖镜观察，也可以用低倍的显微镜观察。

 

3)突变型观察

将果蝇麻醉后，在解剖镜下仔细辨认各种突变类型。与野生型果蝇作对照，观察突变型果蝇的性状表现，如残翅、黑身、黄身、白眼等。经过一段时间的练习，可以直接区别各种不同性状。

果蝇中的一些突变性状和控制该性状的基因如表4-2。

表4-2   果蝇中的一些突变性状及控制流性状的基因

突变型

基因符号

表现特征

基因所在染色体

白眼

棒眼

 

褐色眼

猩红眼

黑檀体

黄体

焦毛

黑体

匙形翅

残翅

翻翅

短翅

w

B

 

bw

st

c

y

sn

b

nub2

vg

Cy

m

复眼白色

复眼条形

小眼数少

复眼褐色

复眼猩红色

身体乌木色

身体浅橙黄色

刚毛卷曲烧曲焦状

颜色比黑檀体深

翅小匙状

翅退化，不能飞

翅向上翻卷，纯合致死

翅膀短小，不超过身体

X

 

X

II

III

III

X

X

II

II

II

II

X

4）配制培养基

培养果蝇用的容器可以采用较粗的指管或用广口瓶，这些容器均需在实验前进行高温灭菌才能使用。可以按如下成分进行培养基的配制：

玉米粉    28g         糖    22g

琼脂       2.5g     酵母粉    2.5g

水           250ml     丙酸       2ml

将上述成分（除酵母和丙酸）放在一烧杯内混合在一起，在电炉上加热，不断用玻璃棒搅拌以免将玉米粉煮糊。煮沸后将烧杯从电炉上取下，稍放置冷却一会儿，将酵母和丙酸加入，用玻璃棒搅拌均匀后分装到5个经高温灭菌的培养瓶内，塞好棉塞备用。注意在分装时不要把培养基倒在瓶壁上。刚配制完的培养基放凉后在瓶壁上会有许多水滴，这时如果把果蝇放进去，水滴可能将果蝇的翅膀粘住，为避免发生此事，可将配好的培养基放在温箱内2～3d，待水分蒸发后再使用，或用酒精棉将瓶壁上的水分擦掉。

5）选处女蝇

用于杂交的亲本雌蝇应该是没有交尾的处女蝇，这样才能保证杂交结果按照实验者所设计的路线进行。那么如何才能得到处女蝇呢？一般来说，刚羽化出来的果蝇在12h之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的8h内挑选。因此，在杂交实验开始的一段时间内，各实验小组要根据自己的实验设计，精心挑选处女蝇。为了操作方便，可以在每天晚上22：00～23：00将培养瓶内的成蝇杀死，次日早晨8：00～9：00对新羽化出的果蝇进行挑选。

6）配制杂交组合

按照所设计的杂交组合，如白眼♀×红眼♂选出白眼处女雌蝇2～3只，红眼雄蝇5～7只共同放入一个培养瓶内。在培养瓶上贴好标签，注明杂交内容、日期、实验组号等，然后将培养瓶放入25℃的培养箱内进行培养。如果温度适宜，也可在实验室的窗台上放置培养。

7）当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本处死以防发生回交

当有F1个体现后，观察其表型，注意显、隐性关系并计数统计。在一个新的培养瓶内放入5对F1配成F1×F1，此时不需要选处女蝇。当看到培养瓶内有蛹出现时，将亲本处死。F2果蝇出现后，进行观察统计，观测数目在200只以上。按照所配制的杂交组合，提出理论假设并根据实验结果进行X2检验。

注意：无论是对F1还是对F2进行统计，都要及时进行，避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾后将卵产在培养基内。因此要求实验者不断进行观察，只要有新羽化出的果蝇就要及时取出并进行统计和观察。

5. 作业及思考题

（1）你如何能准确鉴定果蝇的雌雄个体？要领是什么？

（2）果蝇的生活史分几个阶段，你所观察到的不同类型的果蝇在整个生活史阶段有什么差异？

（3）配制果蝇培养基时应注意什么问题？

（4）仔细观察杂交过程果蝇过程的行为。

（5）记录实验结果，运用统计学方法对实验结果进行分析。你的结果与期望值相符吗？分析实验中出现的问题。

（6）你在实验中有什么新的发现？如何进行解释？

参考文献

1. 王亚馥，戴灼华。遗传学，北京：高等教育出版社，1999。

2. Leand H, Leroy H, Michael L G. Gegetics. McGraw-Hill companies, 2000

3. Graf U, and N. Van Schaik. Drosophila genetics: A preactical course. New york: springer Verlag, 1992.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验三  果蝇唾腺染色体标本的制备和观察

一、目的

1. 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法。

2. 观察了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征。

二、原理

本世纪初，D. Kostoff用压片法首先在D. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。

双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约1000～4000拷贝的染色体丝，合起来达5mm宽，400mm长，比普通中期相染色体大得多（约100～150倍），所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。

唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n=2×4，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第IV和第I（X染色体）染色体为端着丝粒染色体（图21-1）。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起表成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条配对的染色体臂，其5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂（图21-2）。

由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。

三、实验材料

黑腹果蝇三龄幼虫。

四、器具和试剂

双筒解剖镜、显微镜、镊子、小烧杯、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。

五、实验步骤

1. 三龄幼虫的饲养

黑腹果蝇容易饲养，也易获唾腺，但为获得理想的染色体制片标本，需要采用生长良好、形体肥大的三龄幼虫，以保证唾腺发育良好。所以饲养条件稍别于一般杂交饲养。

（1）饲料要求松软，含水量较高，营养丰富，发酵良好。可采用下列配方：

玉米粉100g、红糖130g、琼脂10g、酵母粉20g、苯甲酸0.75g、丙酸3ml、加蒸馏水1200ml。

（2）在接种出现一龄幼虫后，将成虫移去，在饲料表面滴加低浓度的酵母液（2%～4.5%的水溶液），每天滴加1～2滴。2～3龄幼虫期适当增加酵母液浓度（10%左右）。滴加量以覆盖饲料表面一薄层为宜。

（3）饲料营养对幼虫的发育固然重要，但幼虫密度过大亦会影响幼虫发育。故还需控制幼虫密度。这可通过控制成虫排卵时间来达到。一般情况下，牛奶瓶10对成虫交配后12小时左右将成虫转移。

（4）稍低的温度有利于幼虫的充分生长发育，因而可采用15～18℃培养。

2. 唾腺染色体制片

（1）检查幼虫培养瓶，取一适龄幼虫，置于载玻片上，并加上一滴生理盐水（如幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净），置双筒解剖镜下检查。首先熟悉幼虫结构，幼虫具一钝尾和带黑色口器的尖头端。

（2）在解剖镜下用两支解剖针，一针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。因为幼虫会蠕动，这一步需先练习几遍。

（3）幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾端（或用尖头镊子夹住），平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺也随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。

（4）分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，确定取得了腺体后，再用刀片或镊子仔细剔除这些杂物，仅让腺体留下。或将腺体吸到干净玻片上。

（5）用滤纸将多余的生理盐水吸去，注意不要碰着腺体，以防吸走。然后滴一滴醋酸洋红，染色10分钟。

（6）染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余染液，然后放平在桌面，用大拇指压下盖片，可横向揉几下（注意不要使盖片滑动，且只朝一个方向揉动，不要来回揉！），多练习几次，可望获得分散良好的制片。

（7）制好的压片即可在显微镜下观察。亦可制成永久制片，步骤如下：置酒精：冰醋酸（3：1）固定液中固定，待盖片脱落后，再将有材料的载玻片和盖玻片通过下列顺序：95%酒精1分钟，纯酒精1分钟，再经纯酒精1分钟，取出载玻片，加一滴优巴拉尔（euparal）光学树胶，再取出盖玻片盖下，即可。

六、实验结果

检查你制作的制片，寻找形态良好、分散适中的图象仔细观察各条臂的特点。

 

 

实验四  粗糙链孢霉顺序四分子分析

一、目的

1. 了解粗糙链孢霉的生活周期及特性。

2. 通过对粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，了解顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。

二、原理

粗糙链孢霉（Neurospora crassa）属于真菌中的子囊菌纲。它是进行顺序四分子分析的好材料。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分子孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这样形成粗糙链孢霉的无性生殖过程。

粗糙链孢霉除无性生殖过程外，也可以进行有性生殖。粗糙链孢霉的菌株具有两种不同的接合型（mating type），用A, a或mt+, mt-表示。接合型是由一对等位基因控制的，并符合孟德尔分离定律。没接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，有性孢子可很快进入减数分裂。有性生殖过程有两种方式：

1. 当菌丝在有性生殖的杂交培养基上增殖时，就会产生原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。钩状细胞顶端细胞的两核形态合子，合子核再进行减数分裂，分为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成8个核，顺序地排列在一个子囊中。原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子中果。一个子囊果中有30～40个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30～40mm，比3～5mm的分生孢子要大得多。子囊孢子如经60℃处理30～60分钟，便会发芽，长出菌丝，进入无性繁殖。

2. 不同接合型的菌丝相接触，两核配对，但不融合，形成形成双核体，随着双核体菌丝的发育，子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊，即子囊进行发育。在这些尚未成熟的子囊中即含有融合以后形成的二倍体合子。合子形成以后就很快在发育着的子囊中进行减数分裂，形成4个减数孢子，再进行一次有丝分裂，形成8个单倍体的子囊孢子。而整个子囊壳就成为成熟的子囊果（图8-1）。

粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它萌发长出的菌丝亦是单倍体，即它们是减数分裂的产物。所以一对等位基因决定的性状在杂交子代中就可以看到分离。在粗糙链孢霉中，一次减数分裂产物包含在一个子囊中，所以从一个子囊中的子囊孢子的性状特征就很容易直观地看到一次减数分裂所产生的四分体中一对等位基因的分离。而且8个子囊孢子是顺序地排列在狭长形的子囊中，根据这一特征可以进行着丝粒作图，并发现基因转换（geneconversion）。如果两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么杂交所形成的每一子囊，必定有4个子囊孢子属于一种类型，4个子囊孢子属于另一种类型，其分离比为1：1且子囊孢子按一定顺序排列。如果这一对等位基因与子中孢子的颜色或形状有关，那么在显微镜下可以直接观察到子囊孢子的不同排列方式。

本实验有赖氨酸缺陷型（Lys-）与野生型（Lys+）杂交，得到了子囊孢子分离为4个黑色的（+）和4个灰色的（-）。黑色孢子是野生型；而赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，在野生型孢子成熟变黑时，还未变黑，而呈浅灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可知合子在减数分裂时，基因Lys-和着丝粒之间发生交换的情况，最终可有两大类型的子囊出现，即第一次分裂分离子囊和第二次分裂分离子囊（图8-2）。

从图8-2可以明显看出，第二次分裂分离子囊的出现，是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果。即凡由第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，而由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊。第二次分裂分离的子囊越多，则有关基因和着丝粒之间的距离越远。所以由第二次分裂分离子囊的频度可以计算某一基因和着丝粒之间的距离，称之为着丝粒距离。由于交换仅发生在二价体的四条染色单体中的两条之间，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此可据下列公式求出着丝粒与有关基因之间的理组值或图距：

有关基因与着丝粒之间的重组值=交换型子囊数（1/2）/交换型子囊数+非交换型子囊数×100%

三、实验材料

1. 粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+，接合型A，分生孢子呈粉红色。

2. 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a，分生孢子呈白色。

四、器具和试剂

显微镜、镊子、酒精灯、接种针、滤纸、载玻片、试管、培养皿、解剖针。

基本培养基、补充培养基、完全培养基、杂交培养基（以上培养基配方见本实验附录，供选用）、5%次氯酸钠（NaClO）、5%石碳酸。

五、实验步骤

1. 菌种活化：菌种平时在4℃～5℃保存，使用前要先进行活化，以让菌种生长状态良好。只需将菌种分别接在完全培养基试管斜面上，28℃温箱培养5天左右，至菌丝的上部有分生孢子产生。有时，赖氨酸缺陷型在完全培养基上也长不好，需适量添加赖氨酸。

2. 杂交接种：将亲本菌株接种在同一杂交培养基上。具体操作可采用下述方法。

（1）先接缺陷型，后野生型，一次在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝。然后在培养基上放入一灭菌的折叠滤纸，贴上标签，注明亲本及杂交日期。放入25℃温箱进行混合培养。5～7天后就能看到许多棕色原子囊果出现，随后逐渐发育成熟，变大变黑，约14天左右，就可在显微镜下观察。

（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5～7天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，用无菌水中配成近于白色的悬浊液，将此悬浊液加到形成原子囊果的培养表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5mol），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即可成熟。

3. 压片观察：在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分子生孢子飞扬。取一载玻片，滴1～2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附于子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜低倍镜（10×16）下观察，即可见一个果中会散出30～40个子囊。象一串香蕉一样。可加一滴水或次氯酸钠，用解剖针把子囊拨开。此过程不需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出，致使不能分辨子囊类型。观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等物都需放入5%石炭酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。

六、实验结果

1. 观察一定数目的子囊果，记录每个杂交型完整子囊的类型，并计算出Lys基因的着丝粒距离。

子囊类型

孢子排列方式             分离类型

观察数合计

1

2

3

4

5

6

＋＋＋＋――――　　　第一次分裂分离

――――＋＋＋＋

＋＋――＋＋――      第二次分裂分离

――＋＋――＋＋

＋＋――――＋＋

――＋＋＋＋――

}

 

}

2. 实验结果说明

（1）赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟变黑时，缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。如果观察时间选择不当就不能观察到好的结果。过早都未成熟，全为灰色；过迟都成熟了，全为黑色，都不能分清子囊类型。所以最好在子囊果发育至成熟大小，子囊壳开始变黑时，每日取几个子囊果压片观察，到合适时期置于4℃～5℃冰箱条件下，保证在3～4周内观察都行。

（2）有时会观察到下表所示的子囊类型

子囊中孢子的排列

＋：－

可能的出现频率%

1

2

3

4

5

6

7

8

－

－

－

＋

－

＋

＋

＋

4：4

1

－

－

＋

－

＋

＋

＋

＋

5：3

2

＋

＋

＋

＋

－

－

＋

－

5：3

1

＋

＋

＋

＋

－

－

－

＋

5：3

2

＋

＋

＋

＋

－

－

＋

＋

6：2

3

＋

＋

－

－

＋

＋

＋

＋

6：2

1

＋

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

6：2

1

－

－

－

－

＋

＋

－

－

2：6

1

这些子囊类型的出现除观察时间的影响外，第一种4：4的异常排列可能是减数分裂后有丝分裂时纺缍体的重叠造成的第4、第5孢子的位置互换。其它类型则是由基因转换（gene conversion）造成的。

七、思考题

1. 在计算着丝粒距离的公式中，1/2的含义是什么？

2. 假设在基因与着丝粒之间有双交换发生，你的数据和计算结果会发生怎样的偏差？

3. 绘图表示交换型子囊的产生。

附：粗糙链孢霉培养基

（1）基本培养基

柠檬酸·2H2O(Na3C6H5O7·2H2O)      3.0g

KH2PO4                           5.0g

NH4NO3                           2.0g

MgSO4·7H2O                      0.2g

CaCl2·2H2O                      0.1g

微量元素溶液（见（3））          1.0ml

生物素溶液（10mg/ml）           1.0ml

蔗糖                            20.0g

琼脂                            15.0g

                    加蒸馏水至1000ml

(2)杂交培养基

KNO3                            1.0g

KH2PO4                           1.0g

MgSO4·7H2O                      0.5g

NaCl                            0.1g

CaCl2·2H2O                      0.1g

微量元素溶液（见（3））          1.0ml

生物素溶液（10mg/ml）           1.0ml

蔗糖                            20.0g

琼脂                            15.0g

                    加蒸馏水至1000ml

（3）微量元素溶液（基本培养基和杂交培养基用）

柠檬酸·H2O                     500mg

ZnSO4·7H2O                      500mg

Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O              100mg

CuSO4·5H2O                      25mg

MnSO4·4H2O                      5mg

H3BO3                            5mg

Na2MoO4·2H2O                    5mg

                    加蒸馏水至100ml

（4）补充培养基

在基本培养基上补一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。氨基酸用量一般是100ml基本培养基中加5～10mg。

本实验所用补充培养基只要在基本培养基中适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。

（5）完全培养基

基本培养基              1000ml

酵母膏                  5g

麦芽汁（亦可省）        5g

酶解酪素                1g

维生素混合液

硫胺素          100mg

核黄素          5mg

吡哆醇          5mg

泛酸钙          50mg

对-氨基苯甲酸   5mg

菸酰胺          5mg

胆碱            100mg

肌醇            100mg

叶酸            1mg

蒸馏水          1000ml

蔗糖                        20g

（为获大量分生孢子，可用1%的甘油代替蔗糖）。

加2%琼脂，即为固体完全培养基。

（6）马铃薯培养基

将马铃薯洗净去皮，切碎，取200g,加水1000ml，煮热，然后纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2%琼脂，20g蔗糖，煮融，分装到试管中。亦可将马铃薯切成黄豆大小碎块，每支试管放4～5块，再加入融入化好的琼脂，蔗糖。

上述培养基分装试管后，55.2kPa（8磅）灭菌30分钟，取出摆成斜面，可代替完全培养基使用。

（7）玉米杂交培养基

将玉米浸泡软化，破碎，每管3～4粒，加入少量琼脂（0.1g左右），加棉塞消毒，即成，不需碎面。

 

 

实验五   微核检测技术

一、目的

1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。

2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。

二、原理

微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。

本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试和蚕豆根类微核测试技术。

三、实验内容

（一）小鼠骨髓细胞的微核测试

骨髓细胞微核测定的阳性药物可用环磷酰胺，为加强阳性效果，剂量可适当加大。给药途径视实验要求而定。

1. 实验材料

成年小鼠，雌雄均可。

2. 器具和试剂

显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖器具。环磷酰胺（1mg/ml）溶液、生理盐水、小牛血清（或1%柠檬酸钠溶液）、甲醇、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）、Giemsa原液。

3. 实验步骤

（1）按40mg/g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液诱发微核（若进行其它因子测定或自然环境测定按下线步骤直接操作）。

（2）处理24～36小时后，小鼠采用脱颈椎处死，迅速剥取两根股骨，剔净肌肉等软组织，并擦净股骨上的血污。

（3）剪去肌骨两端关节头，用注射吸收2～3ml预温到37℃的生理盐水，然后将针头插入股骨腔，尽量将骨髓细胞冲洗出来，置于10ml试管中把细胞团用吸管吹打散，然后将细胞悬液转入离心管内，弃去残渣。

（4）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，尽量不留残液。滴加2～3滴灭活小牛血清，将细胞轻轻吸打均匀。

（5）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，再加1滴灭活小牛血清，用吸管轻轻混匀。

以上两步的小牛血清亦可用1%檬檬酸钠代替，但注意两步须在15分钟内完成。

（6）滴一小滴细胞悬液在清洁的载玻片上，涂成均匀涂片，在空气中干燥。

（7）放入甲醇中固定10分钟，干燥后，用不着：9Giemsa染液（1份原液，9份pH 6.8磷酸缓冲液）染色10分钟，迅速用缓冲液洗片，让其干燥，即可用于观察。

4. 实验结果

选择细胞密度适中，铺展均匀，染色良好的地方，随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均可见到微核，但是在只有少量孢浆的有核细胞微核细胞常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别。而在无核的嗜多染色细胞的胞浆中，微核却易于辨认。因为嗜多染色细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞，在它完成最后一次有丝分裂后几小时将其主核排出，而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此一般观察计数嗜多染色红细胞中的微核。

嗜多染红细胞经Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞呈枯红色。微核大多数呈圆形或椭圆形，边缘光将整齐。嗜染性与核质一样，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000～2000的嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示，一个嗜多染红细胞出现一个以上微核，仍按一个细胞计数。

正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之2.58%+0.41%，即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，趣味这千分之五为异常。统计你所测定的材料的微核率。

（二）蚕豆根尖微核测定试技术

1. 实验材料

松滋青皮豆。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对诱变因了反应敏感的品种。本品种引入后的栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒农药，以保持该品种较低的本底微核值。也可用其它蚕品种，但是必须设置对照组。种子成熟后，晒于藏干燥器内或4℃冰箱内备用。

2. 器具和药品

显微镜、手动计数器、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、瓷盘。6mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、醋酸洋红、CrO3、NaN3（又氮钠DMS（甲基磺酸乙醚）。

3. 实验步骤

（1）浸种催芽：将实验用蚕豆按需要量放入盛有自来水（或蒸馏水）的烧不中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两次，所换水应25℃预温。种子吸胀后，用纱布松散包裹置瓷盘中，保持温度，在25℃温箱中催芽12～24小时，待初生根长出2～3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至1～2cm左右，根毛育良好，这时即可用来进行检测了。

（2）用被检测液处理根尖，每处理选6～8粒初生根生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸没根尖即可。阳性因子可采用CrO2、NaN3、EMS，为加强阳性效果可适当加大浓度，1.0～2.5mol/L CrO3、0.5～1.5mol/L NaN3和150-220mol/L EMS溶液。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖12～24小时时，此时间亦可视实验要求和被测液浓度而定。

（3）根尖细胞恢复培养：处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2～3分钟表。洗净后再置入辅有混润滤纸的瓷盘中，25℃下再恢复培养22～24。

（4）根尖细胞固定：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用甲醇：冰醋酸（3：1）液固定24小时。固定后的根如不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中置4℃冰箱中保存备用。

（5）酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5分钟，吸净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分钟，幼根软化即可。

（6）染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次，每次1～2分钟。最后浸于水中。制片前了出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5～8分钟，加车盖玻片，压片观察。

4. 实验结果

首先在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测指标。

根据你的实验安排列表填出你的实验结果。

若进行污水检测，根据。

污染指数（PI）=样品实测MCN%平均值/对照组（标准水）MCN%平均值

鉴定出你所测水样的污染程度，也可以计算被检化学药剂的污染指数。

污染指数在0～1.5区间基本没有污染

1.5～2区间为轻度污染

2～3.5区间为中度污染

3.5以上为重度污染。

四、思考题

1. 试比较动物和植物系统的微核测试方法。

2. 在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？

3. 产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图象？实验观察中请同时仔细观察每个分裂相细胞。

 

 

 

实验六   荧光原位杂交实验

1. 实验目的

通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

3. 实验用具及材料

Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。

4. 实验方法及步骤

1）探针及标本的变性

（1）探针变性

将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

（2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。

③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

2）杂交

将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

3）洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。

（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。

（4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。

4）杂交信号的放大

（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。

（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。

（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。

（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。

（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。

（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5）封片

可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

6）荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果（图16-1）。

 

 

5. 作业及思考题

（1）通过实验总结荧光原位杂交实验的技术关键。

（2）实验中会不会出现假阳性，为什么？

附录I   FISH相关溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。

2）去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸过滤。

3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6）杂交液：8mL体积分数25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。

7） PI/antifade溶液

PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。

Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。

PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。

8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。

9）封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。

10）封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。

11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。

12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。

13）TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

               pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

               pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。

14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。

16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。

17）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。

 

 

附录II  DNA探针的制备

质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。

1）用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。

2）将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。

3）向菌体沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1：1）500mL 后充分混匀。

4）12000r/min离心10min。

5）取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心15～30min，弃掉上清液。

6）用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。

7）用TE缓冲液溶解DNA沉淀。

8）加水至200mL，以Rnase A（终浓度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。

9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25：24：1）溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。

10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24：1）200mL混匀，12000r/min离心2min。

11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。

12）可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。

13）将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。

14）用TE缓冲液溶解DNA。

15）取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。

16）取1mg DNA，用相应限制性内切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。

17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。

 

附录III   探针的生物素标记

探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。

总反映体积50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL。

其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8)

50mmol/L MgCl2

100mmol/Lβ-硫基乙醇

100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白

0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP

0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP

10×酶混合为：

                  0.5units/mL DNA聚合酶I

                  0.075untis/mL Dnase I

                  50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)

                  5mmol/L醋酸镁

                  1mmol/L β-硫基乙醇

                  0.1mmol/L苯甲基磺酰氟

                  体积分数50%甘油

                  100mg /mL牛血清白蛋白

将上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500bp为宜。如片段较大，则应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液（300mmol/L EDTA）终止反应。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。

 

附录IV  所用不同荧光染料的激发光和发射光波长及滤光镜选择

 

表16-1 所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择

荧光染料

激发波长（nm）

发散波长（nm）

适用激发光

异硫氰酸荧光素

异硫氰酸四甲基罗丹明

得克萨斯红

色霉素

2’[4-羟基苯]-5-[4-甲基-派嗪]-2，5’二进制H-苯并咪唑

碘化丙啶

罗丹明毒伞素

4，6-二氨基-2-苯基吲哚

490

511

596

450

365

 

530

550

372

520

572

620

570

465

 

615

680

456

IB

IG

IY

B，VB

U

 

IG，G，IG

G，IG

U

参考文献

1. 陈乐真，张杰。荧光原位杂交技术及其应用。细胞生物学杂志，1999，21（4）：177-180

2. 韩方普，何孟元，卜秀玲等。应用FISH技术鉴定一个小冰麦易位系。植物学报，1998，40（6）：500-502

3. 斯佩克特DL，戈德曼RD，莱因万德LA。细胞实验指南。黄培堂等译，科学出版社，2001。

4. Lichter P, Gremer T, Borden J et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum. Gene 1998, 80: 224-234.

 

实验六   荧光原位杂交实验

1. 实验目的

通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

3. 实验用具及材料

Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。

4. 实验方法及步骤

1）探针及标本的变性

（1）探针变性

将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

（2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。

③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

2）杂交

将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

3）洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。

（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。

（4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。

4）杂交信号的放大

（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。

（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。

（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。

（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。

（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。

（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5）封片

可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

6）荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果（图16-1）。

 

 

5. 作业及思考题

（1）通过实验总结荧光原位杂交实验的技术关键。

（2）实验中会不会出现假阳性，为什么？

附录I   FISH相关溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。

2）去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸过滤。

3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6）杂交液：8mL体积分数25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。

7） PI/antifade溶液

PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。

Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。

PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。

8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。

9）封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。

10）封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。

11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。

12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。

13）TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

               pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

               pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。

14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。

16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。

17）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。

 

 

附录II  DNA探针的制备

质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。

1）用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。

2）将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。

3）向菌体沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1：1）500mL 后充分混匀。

4）12000r/min离心10min。

5）取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心15～30min，弃掉上清液。

6）用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。

7）用TE缓冲液溶解DNA沉淀。

8）加水至200mL，以Rnase A（终浓度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。

9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25：24：1）溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。

10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24：1）200mL混匀，12000r/min离心2min。

11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。

12）可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。

13）将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。

14）用TE缓冲液溶解DNA。

15）取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。

16）取1mg DNA，用相应限制性内切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。

17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。

 

附录III   探针的生物素标记

探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。

总反映体积50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL。

其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8)

50mmol/L MgCl2

100mmol/Lβ-硫基乙醇

100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白

0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP

0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP

10×酶混合为：

                  0.5units/mL DNA聚合酶I

                  0.075untis/mL Dnase I

                  50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)

                  5mmol/L醋酸镁

                  1mmol/L β-硫基乙醇

                  0.1mmol/L苯甲基磺酰氟

                  体积分数50%甘油

                  100mg /mL牛血清白蛋白

将上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500bp为宜。如片段较大，则应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液（300mmol/L EDTA）终止反应。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。

 

附录IV  所用不同荧光染料的激发光和发射光波长及滤光镜选择

 

表16-1 所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择

荧光染料

激发波长（nm）

发散波长（nm）

适用激发光

异硫氰酸荧光素

异硫氰酸四甲基罗丹明

得克萨斯红

色霉素

2’[4-羟基苯]-5-[4-甲基-派嗪]-2，5’二进制H-苯并咪唑

碘化丙啶

罗丹明毒伞素

4，6-二氨基-2-苯基吲哚

490

511

596

450

365

 

530

550

372

520

572

620

570

465

 

615

680

456

IB

IG

IY

B，VB

U

 

IG，G，IG

G，IG

U

参考文献

1. 陈乐真，张杰。荧光原位杂交技术及其应用。细胞生物学杂志，1999，21（4）：177-180

2. 韩方普，何孟元，卜秀玲等。应用FISH技术鉴定一个小冰麦易位系。植物学报，1998，40（6）：500-502

3. 斯佩克特DL，戈德曼RD，莱因万德LA。细胞实验指南。黄培堂等译，科学出版社，2001。

4. Lichter P, Gremer T, Borden J et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum. Gene 1998, 80: 224-234.

 

 

实验八   遗传平衡定律

1. 实验目的

通过实验进一步理解Hardy-Weinberg定律的原理；以果蝇为模式生物，人工模拟选择对基因频率和基因型频率改变的影响。

2. 实验原理

Hardy-Weinberg定律是群体遗传学中的基本定律又称遗传平衡定律，该定律于1908年由英国数学家G. H. Hardy和德国医生W. Weinberg共同建立的。它的基本含义是指在一个大的随机交配的群体中，在无突变、无任何表式的选择、无迁入迁出、无遗传漂变的情况下，群体中的基因频率和基因型频率可以世代相传不发生变化，并且基因型频率是由基因 频率决定的。它的推导过程包括3个主要步骤：1）从亲本到其产生的配子；2）从配子结合到产生合子的基因型；3）从合子基因型到子代的基因频率。 a2 + 2pg + q2 = 1是在一对等位基因的情况下的遗传平衡公式。它表示在一个大的随机交配的群体中，一对等位基因所决定的性状，在没有迁移、突变、选择和漂变的情况下，整个群体的基因和基因型频率的总和都等于1，符合这一条件的群体称作平衡群体。

3. 实验用具及材料

普通果蝇（Drosophila melanogaster）及残翅突变型果蝇、双筒解剖镜、麻醉瓶、毛笔、白板纸、乙醚、玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等。

4. 实验方法及步骤

人工模拟选择对果蝇正常翅、残翅等位基因的基因频率的影响

（1）选用两个纯合的果蝇群体，即正常翅和残翅类型。分别从2个群体中选取雌处女蝇和雄蝇各20只，共同放入一个大的培养瓶内，放入25℃培养箱内培养。记录亲本正常翅和残翅的只数。并计算此时群体中正常翅和残翅基因的频率。

（2）当发现培养瓶内有幼虫或蛹出现及时将亲本处死，以防发生回交。当有F1个体出现后，观察其表型，记录F1正常翅和残翅的只数。

（3）将F1群体中出现的残翅个体全部处死。在一个新的培养瓶中分别放入20只正常翅雌蝇和雄蝇继续培养。即F1×F1，此时不需要选处女蝇。培养至有F2代产生。记录F2正常翅和残翅的只数。

（4）将F2群体中出现的残翅个体全部处死，在一个新的培养瓶中分别放入20只正常翅雌蝇和雄蝇继续培养，配成F2×F2。记录F3中正常雌和残翅的只数。

（5）进行与（4）同样的实验步骤，直至记录到F4和F5。

（6）计算基因频率和基因型频率，将数据填入下表。

表21-2   基因型频率和基因频率统计

 

基因型频率

基因频率

 

正常翅

残翅

正常翅（p）

残翅（q）

P

 

 

 

 

F1

 

 

 

 

F2

 

 

 

 

F3

 

 

 

 

F4

 

 

 

 

F5

 

 

 

 

…

 

 

 

 

…

 

 

 

 

5. 作业及思考题

（1）实验一中的数据是否满足遗传平衡公式？为什么？

（2）实验二的设计思路是怎样的？模拟了怎样的选择影响？结果怎样？

（3）通过实验二的结果，判断正常翅基因 （Vg）和残翅基因（Vg）的显隐性关系，并说明是如何判断的。

（4）实验至F5代时还有残翅基因存在吗？为什么？请推导出残翅基因频率在上述选择情况下随交配代数的变化通式。

（5）实验二设计上有什么样的缺陷，如何弥补？你可以作出怎样的改进？

（6）讨论如果在F1留种时，只随机保留一只雄蝇和雌蝇将会出现怎样的情形？自然界中有这种情况出现吗？

（7）请你设计一个可以操作的实验，考察迁移对群体基因和基因型频率的影响。

参考文献

1. Thomas R M, Robert L H. Genetics. Laboratory Investigations. New Jersey: Prentice Hall. Upper saddle River, 2001.

2. Leland H, Leroy H, Michael L G. Genetics. McGraw-Hill compaines, 2000.

实验九