4．细菌的遗传重组分析
经典遗传学是在研究高等动植物有性生殖过程中遗传变异规律的基础上发展和建立起来的，它对于细菌和病毒这样的生命形态也适用吗？
在1943年以前细菌遗传学漫长的孕育期中，人们反复地对细菌间的两性现象进行了研究，但一直得不到肯定的结果。主要原因有二：一是无法在形态学上找到细菌之间接合或融合的证据，而这类证据只有用电镜技术才可获得；二是没有把细菌的性状研究和遗传分析结合起来，得不到遗传学上的判断性依据。四十年中期，J.Lederberg在Luria和Delbrück做的确定细菌突变的自发性本质的实验和分析方法的启示下，开始用遗传分析的方法来研究E.coli的遗传重组。
（1）经典的杂交实验
早在三十年代，就有人对细菌的杂交进行过尝试，但由于方法不对，又未找到合适的材料，所以失败了。直到1946年Lederberg和Tatum在思维方法和工作方法上有独到之处，实验才取得了成功。他们成功的原因主要有3个方面：
①注意了出发菌株的明确性和稳定性——多缺
1937年，有人对E.coli的各种糖发酵有差异的菌株进行混合培养，然后从培养物中分离菌落，观察这些菌落中有无关于糖发酵的新组合出现。然而由于糖发酵这种性状很不稳定，易受内外环境影响，又难以进行观察分析，所以没有成功。
1942年，又有人对菌落颜色和表面形态为出发性状进行研究，这两种性状更不稳定，虽然做了大量工作，分离观察了上万个菌落，但一无所获。
正如Mendel所说：“历史会使人聪明”。Lederberg吸取了前人的经验教训，认为较妥善的方法应该是将两种不同的营养缺陷型（auxotroph）细菌“杂交”，即把它们在完全培养基中混合培养，然后把培养物的试样涂布在基本培养基上来挑选任何可能出现的稀有的原养型（prototroph）。但Lederberg也考虑到，如果E.coli bio-和leu-混合培养后在基本培养基上出现原养型菌落，它可能是两个突变型品系杂交和重组的产物，但也不能排除bio-或leu-发生自发回复突变的可能性，因这样也产生原养型菌落，尤其是当细菌的重组频率与回复突变频率都很低时（一般为10-7或10-8），两者是不能区分的。Lederberg于是产生了一种想法，必须在多营养缺陷型（multiple
auxotrophs）之间进行杂交，就可以把突变型菌回复为野生型菌的可能性降低到几乎为零（如E.coli leu-bio-→leu＋bio＋的概率为10-8×10-8=10-16）。当决定用“多缺”作杂交实验时，感到为制备“多缺”所需的工作量太大，单干不了，于是就去找在斯坦福大学工作的Tatum合作。这次合作不料成为科学史上的一桩幸运的事，很快取得了成功。在同一年的第11届冷泉港学术会议上宣读了他们关于细菌杂交研究的论文。这次会议首先是由Beadle宣读了他和Tatum合作研究得出的“一个基因一个酶”的理论。当Lederberg宣读完论文后，使会议讨论的方向立刻由“一个基因一个酶”转向细菌的杂交，Lederberg成了新闻人物，名声大震，而Tatum也成为倍受人们尊敬的老前辈。
②采用了选择培养的方法
细菌的重组率一般为10-7。要在一千万个细菌中找出一个重组体，在理论上是可行的，但实际上尤如大海捞针一样，是行不通的。所以他们采用了选择培养的方法，使工作量大大减轻。如要选择抗链霉素突变型细菌，则在培养基中加入链霉素，能存活的少数菌落即是Strr。这种培养基就叫选择性培养基（Selective Medium）。
③选用了K12品系（Strain）
这个品系是Beadle和Tatum在斯坦福大学细菌学教学中使用很多年的一个品系。后来才知道，K12是能育的（因有F因子）。如果他们当初不用这个品系，而用当时在许多实验室中大多数人乐于使用的其它品系（后来知道它们是不育的，因无F因子），他们的合作肯定会失败。可见偶然性在科学研究中有时起着决定性的作用，但这种偶然性不是谁都可以碰上的，正如华罗庚所说：“偶然性只有给予那些勤奋的人，而决不给懒汉”。
他们的实验如下图所示：
在基本培养基上长出的菌落一定是原养型（+++++）。但是否得出结论说明A、B二品系通过杂交发生了重组？还不能。Lederberg和Tatum当时认为有另外两种可能也会出现原养型菌落，所以又做了两个补充实验：
a.原养型菌落的出现不是回复突变的结果
虽然A品系的回复突变率为10-8×10-8=10-16，B品系的回复突变率为10-8×10-8×10-8=10-24，为排除这种可能性，将A、B分别接种在基本培养基上，无菌落出现，说明不是回复突变的结果。（见图示）。
b.原养型菌落的出现也不是转化作用
由于肺炎球菌的遗传转化在这项实验进行的时候已是众所周知，那末这个实验结果是不是观察到的另一例转化作用？为此，Lederberg和Tatum把培养A（或B）的培养液进行灭菌，使细菌发生迸裂，将滤液加入到培养B（或A）的培养液中，经培养后没有产生原养型菌落，可排除是转化所致。
由此他们得出，原养型菌落的出现，两个缺陷型细菌的直接接触是必须的。
以后又有人做过一些实验，更进一步证实了
上述结论：
a.B.Davis1950年所做的U形管试验
烧结玻璃滤器的微孔也可使DNA、噬菌体等
生物大分子通过。当细菌生长达到生理饱和密度
时，缓慢抽吸培养液。然后将U形管两臂的菌样
涂布在MM上，结果没有原养型菌落出现。这一
试验排除了转化、转导和互养3种可能性，证实
Lederberg和Tatum 1946年的实验结果确实是细
菌杂交而引起的遗传重组。
b.为排除转化作用，还有人将DNase分别加入A、
B菌液中然后共同培养，仍在MM上长出原养型菌
落，频率为10-7。
c.为排除互养，又设计了两个实验：
互养（Syntrophism）——两个品系分泌的代谢
物通过培养基互为利用而得以生长的现象。
实验1：如果互养，则不能稳定遗传。所以将A、B混合培养后在MM上长出的原养型菌落游离为单个细菌培养在MM上，长出的仍是原养型细菌，可稳定地遗传，不是互养。
实验2：
A品系
B品系
- - + + + T1S
+ + - - - T1r
A被杀死了，谈不上互养，菌落的出现只能是由于A、B品系的直接接触中交换了遗传物质而形成的原养型菌落。
Lederberg和Tatum开始做实验时，为了减少工作量，采用了选择培养的方法。如在A＋B-×A-B＋的杂交中只使A＋B＋在MM上生长，其它3种基因型（A＋B-，A-B＋，A-B-）的细菌都不能生长。在这里A＋、B＋基因是选择性标记（Selected marker,在杂交中用来选出杂交子代重组体的基因标记）。然而，要证明基因重组就必须研究基因的分离。A＋B-×A-B＋中，如果4种子代都能在培养物中表现，就可证明这个杂交确实发生了基因的分离和重组。解决这个问题的方法叫做非选择性标记分离分析法：把选择性标记和非选择性标记结合起来，以选择性标记来选择杂交重组体，以非选择性标记来观察分离现象。
下图是非选择性标记分离分析法的示意图。从这个设计可以看出怎样巧妙地运用选择原理来满足特定的实验研究的需要。
A-B-C+D+lac-strrTons
× A+B+C-D-lac+strsTonr
A+B+C+D+是选择性标记（用以选出杂交子代重组体的基因标记）。
Lac、str、Ton是非选择性标记，杂交后理论上应有23=8种表型。
A+B+C-D- Lac+strsTonr A-B-C+D+ lac-strrTons Str T1 加C、D物质，加lac的EMB 培养基接种时横向划一条线，因为是lac+,所以菌落是带金属光泽的紫红色。划线后培养前垂直方向划Str和T1，培养后如图示。
Lac+StrsTons Lac-StrsTons Lac+StrsTonr Lac-StrsTonr Lac+StrrTons Lac-StrrTons Lac+StrrTonr Lac-StrrTonr Str T1 Str T1
通过以上实验，Lederberg和Tatum将细菌的杂交解释为：细菌的杂交就像真核生物的有性过程一样，先是细胞融合，形成二倍体合子，再经减数分裂，形成细菌子代，其中包括亲组合和重组合。所以他们的结论为：细菌的接合作用（Conjugation）是同宗配合（homothallic），即两个接合的单倍体细胞在接合过程中起着同等的作用。
细菌的接合真的是同宗配合吗？
（2）W. Hayes的实验
1952年Hayes在实验中惊奇地发现，细菌的接合不是同宗配合。他的实验是：
实验一：品系A：met- thr+ leu+ thi+
品系B：met+
thr- leu- thi-
根据用高剂量的str处理E.coli菌株，不会立即将它们杀死（但很快会杀死），而可以阻止其细胞分裂这一特点，设计了本实验（现已证实，str抑制E.coli核糖体S12蛋白质的翻译而阻止细胞分裂，使E.coli致死）。
实验分3个处理：
①将高剂量str处理过的A跟未处理的B混合培养一定时间后，接种在MM上。（处A+B）；
②将高剂量str处理过的B跟未处理的A混合培养一定时间后，接种在MM上。（A+处B）；
③对照（A、B均未处理）。（A+B）
结果：（1）MM上长出菌落，f=10-7。
(2) MM未长出菌落，f=0。
(3)MM上长出菌落，f=10-7。
怎样解释这一现象呢？Hayes认为，E.coli中遗传物质的交换不是交互的，而是单向转移的。其中品系A作为遗传物质供体（donor），品系B作为遗传物质的受体（host,
competent, recepter, recipient）。在亲体细胞间发生接触的情况下，品系A将遗传物质进入受体品系B的细胞中，在B中发生遗传重组，这里受体B被认为是“合子之家”。
当用高剂量的str处理供体品系A，并立即和B品系混合涂布时，A品系已将遗传物质转移给了B品系，即使A品系被杀死了，在B内仍可发生遗传重组而形成在MM上可生长的原养型菌落。
但是，高剂量的str处理过的B品系和未处理的A混合涂布时，A，B接触后，即使是A将遗传物质转移给了B，但遗传重组是发生在B细胞中的，而作为“合子之家”的B细菌在高剂量str下总要死亡的，这正像动物中的情况一样，雌雄亲本交配受精后，杀死雄体不会影响杂交子代的产生，可是杀死雌体就不会有子代产生了。所以处理②就不会有原养型菌落出现。所以，Hayes结论说，细菌的接合作用是一个异宗配合（heterothallic）过程。即两个接合亲体细菌在重组过程中所起的作用不同，供体相当于雄性，受体相当于雌性。
实验二：正反交实验
Astrr × Bstrs 或 Astrs × Bstrr
（正交）
（反交）
MM，原养型菌落 f=10-7
如果在MM上加str，正反交结果完全不同：
Astrr × Bstrs
Astrs × Bstrr
（正交）
（反交）
实验三：从不育的Astrr“♂”中选育能育的Astrr♂品系。
Hayes以上实验证明细菌接合是异宗配合后不久，又在一个偶然的机会里发现了F因子，过程是：
Astrs （供体，相当于♂，冰箱 保存称作原始A品系）
④ 因为②失去了 供体的功能。
由此可见，①→②，失去了供体的功能，因为不能和④接合。但和①接合后成为②′后，又具供体性质，可和④结合了。说明原始品系A中有一种作为供体所必须的因子，后者可转移：①×②，使②具供体性质。也可丢失，①→②。
在完成这些实验之后不久，Hayes获悉J.Lederberg和他的妻子E.Lederberg以及Cavalli也用他们的品系A和B作出了完全类似的发现。于是在他们4个人之间，对E.coli杂交的能育性问题及其它问题，达成了以下一致的理解，有以下4点：
①E.coli的某些品系（如品系A）具有供体性质，这是由一个性因子或能育因子所决定的，可用F来代表（Fertility factor,致育因子；Sexual factor，性因子），记作F+，相当于♂性；而另一些品系，如品系B和品系A的不育型（上图②）不带有性因子F，记作F-，具有受体性质，相当于♀性。
②为了使任何的杂交都是能育的，就要求在两亲本中至少有一个亲本含有F因子，据此：
杂交F+×F-是能育的，F-×F-则是不育的。F+和F+也不能接合，因为二者有相互排斥的倾向。
③F因子可以由供体细胞以一定的频率转移给受体细胞，使受体细胞变为供体细胞。这种传递频率是很高的。当进行F+×F-杂交时，每10个亲体中就可能有一个F-细菌由于得到F因子而转为F+，而染色体基因的重组频率却只有1/107。
④F因子可自发地丧失。一旦丧失就不再恢复，只能从另一个F+传递过来。（上图中①→②，②又从①中获得F因子。）
氮芥气处理
（3）L.Cavalli的实验
1951年，Lederberg的合作者Cavalli将经典的AF+品系
“新品系”×BF-，得到的重组体比AF+×BF-高出1000倍之多，他把这个“新品系”定名为Hfr C(High frequency
recombination)。
3年后，Hayes又从AF+中分离出HfrH。接着他们从AF+中分离出很多Hfr，依次定名为HfrC1,C2……,HfrH1,H2……
通过对Hfr的分析得出：
①Hfr×F-可得到重组体，说明Hfr是供体，♂性；
②Hfr×F-虽然可出现重组体，但F-不能变为F+，这和F+×F-不同，后者不要2小时，可使90%以上的F-→F+；
③Hfr×F-时，在F-中出现了Hfr的性状，但只能转移Hfr的一部分基因组，另一部分性状几乎不能转移。
怎样解释这种现象？
Hayes根据Hfr能一再从F+中得到，但从未在F-中获得，所以假定Hfr是从F+变化而来的，F+→Hfr后，F因子发生了“永久性改变”，使得Hfr×F-时不能使F-→F+，但能将本身基因组的有限部分转移给F-。
当时，人们对Hayes解释的评论是：简单而又中听。实际上是不承认这个解释。所以在细菌遗传学的同仁中没有得到普遍的接受，一直争论了好几年。
（4）E.Wollman和F.Jacob的中断杂交实验
Hfr×F-时，Hfr怎样把它的基因转移给F-？当时在世界上第一流装备的实验室，一些相当有名气的科学家都在致力于这方面的研究，其中最出色的是法国巴斯德研究所的Wollman和Jacob 1957年所做的中断杂交实验（interrupted mating experiment）。
Hfr:strs azir tonr
lac+gal+
F-
:strr azis tons lac-
gal-
标记基因：azi 叠氮化钠
ton Ti
lac
乳糖发酵基因
gal 半乳糖发酵基因
对Hfr除选择标记基因外，还应有一个末端敏感基因，这样才不致于使Hfr菌株在一定的选择培养基上生长，而只能使重组体生长，如Hfr是strs。
实验程序是：
①将Hfr和F-混合在培养液中通气培养（Hfr:F-≈1:10,108/ml个细菌），使二者能悠闲地接触。
②每隔一定时间取混合菌液于组织搅拌器（Votex, 一种简便的中断装置）中搅拌，使已接触的Hfr和F-细菌中断交配。然后把这种混合菌液稀释涂布于含有Str的不同选择培养基上，Hfr被杀死，长出的菌落一定是重组体。
实验结果如下图所示：
时间(分钟)
从图中看出，Hfr菌株中的4个基因进入F-细菌中的数量和时间是各不相同的。随着时间的推移，具有4个基因的菌落百分数也逐渐增加，但菌落增长率方式各不相同：
azir在接合8¢后出现，24¢时，90%的F-具azir基因；
tonr在接合10¢后出现，24¢时，80%的F-具tonr基因；
lac+在接合17¢后出现，30¢时，不到40%的F-具lac+基因；
gal+在接合25¢后出现，40¢时，只有20%的F-具gal+基因。
从以上结果可得出以下5条结论：
①遗传性状发生改变的是F-细菌（受体）。
②如果搅拌时间过早，如7¢，则F-性状没有任何改变。
③供体Hfr的每个标志基因在受体F-中出现的时间是确定的。如azir在接合后8分钟开始出现，tonr10分钟，lac+17分钟，gal+25分钟。
④供体的标志基因在重组子中的出现有严格的顺序，如azir-tonr-laz+-gal+.
⑤进入受体细胞越早的标志基因，在重组子中能达到的最大比值也越高；反之，进入越迟的，能达到的转移比值上限也越低。如最先进入受体细胞的azir极值为90%，而最迟进入gal+则不及25%。
在综合分析了多次杂交资料的基础上，Wollman和Jacob推测，Hfr的染色体是以线性方式转移进入F-的。它以某一特定位点为转移起点（设为O点），以一定的次序将染色体上的基因转入F-细胞。azir基因距O点较近，所以在两亲体混合约8¢后，可在选择培养基上观察到一定数量的抗叠氮化钠的菌落。随着时间的推移，tonr,lac+和gal+也陆续鱼贯而入F-细胞。离O点较远的基因往往在进入F-之前，被某些因素阻断，所以产生重组子的比例就很低。他们还进一步设想，如果染色体转移是匀速的，那么根据Hfr基因出现在F-中的时间间隔为单位就可绘出细菌基因的连锁图。如本例4个基因的连锁图可表示为：
Morgan的创造性构想是以重组百分率作为基因在染色体上的距离，而Wollman和Jacob则把时间这样的物理量在细菌遗传学中赋予了深刻的生物学意义。
Wollman和Jacob不断延长Hfr和F-接合的时间以求得更完整的连锁图时发现，当接合时间为120¢时，一部分重组子由F-变为Hfr。这暗示F因子也可以是细菌染色体上的一个标志基因，而且是染色体转移的终点。于是他们产生了一个极富创造性的构想：在F+中，F因子是游离于染色体之外的，而在Hfr中，F因子是染色体的一部分，是供体细胞的基因向受体细胞转移的最后一个标志。
Wollman和Jacob用不同的Hfr品系进行了8组中断杂交实验，目的是想建立各个Hfr品系把它们染色体上的基因转移给F-的次序，从而给出E.coli基因的连锁图。下表列出了5株Hfr菌的基因连锁顺序。
|
品系 |
连锁次序 |
|||||||||
|
Hfr H |
O |
thr |
pro |
lac |
pur |
gal |
his |
gly |
thi |
F |
|
Hfr 1 |
O |
thr |
thi |
gly |
his |
gal |
pur |
lac |
pro |
F |
|
Hfr 2 |
O |
pro |
thr |
thi |
gly |
his |
gal |
pur |
lac |
F |
|
Hfr 3 |
O |
pur |
lac |
pro |
thr |
thi |
gly |
his |
gal |
F |
|
AB 312 |
O |
thi |
thr |
pro |
lac |
pur |
gal |
his |
gly |
F |
从此表可以看出以下两点：
①所选用的Hfr品系不同，连锁图也不同。
②任何一个基因都似乎有资格作为转移原点的邻居，所以基因的次序好象改变了，有的甚至颠倒了。
这是在其它生物中未出现过的特殊现象。
但仔细研究一下就会发现，在一个Hfr品系中某几个基因是邻居，那么在另一个Hfr中也必然是邻居，如his—gal—gly，其它也如此，唯一不同的是原点的位置有所改变。
为了解释这个意外的结果，他二人于1957年提出了另一项出人意料的假设：
F+细菌的染色体是环状的，可在不同位置上自发地断开，原点可接在断头的无论哪一端上，如：
这样就成为Hfr，所以Hfr是线状的，这样再和F-杂交时，就会出现表中所表示的基因顺序。
细菌的环状染色体于1963年由J.Cairns在研究E.coli DNA复制机理时获得的电镜照片所证实，以后又有一些实验相继证明了这个结论。现在凡是有一些遗传学知识的人都知道细菌染色体是环状的，但很难设想早在40多年前的1957年这两个人所具有的天才的想象力是何等的大胆和令人惊奇！虽然他们的建议有些是错误的，如认为Hfr是线状的。
后来的研究证实Hfr也是环状的。那末F+怎样变为Hfr的？A. Camphell提出，F因子也是一个分子量较小的环状DNA分子，它由3个部分组成，如图所示：
原点：O，决定断裂和转移方向的转移起始点。
致育因子
配对区，能和染色体上多处同源区配对的区域
这样两个环状DNA分子通过一次交换就整合成为一个大的环状DNA分子（Hfr）。Camphell关于F因子整合于细菌染色体的模型（Camphell model）有3个要点：
①两个环状DNA分子在同源区配对。
②通过一次交换F因子整合于染色体，使基因顺序颠倒。
③整合后，原先的两部分DNA具结构同线性。
图示如下：
由F因子的这些特点，Wollman和Jacob给这个新型的遗传单元下了一个定义：F因子既可以游离于细胞质中，又可整合到染色体上，具有这两种存在状态的遗传因子称为附加体（episome）。
他们把F-，F+，Hfr三者之间的关系图示为：
和F+杂交 时获得 游离 F-
由于F因子插入细菌染色体的位置是随机的，方向是两可的（顺、反时针），所以就有许多不同的Hfr品系，这样就出现了上述表中基因在不同品系中连锁次序的变化。
（5）E.Aderlberg的发现
1959年，Aderlberg试图以Wollman和Jacob前不久分离出来的Hfr品系为材料做接合实验时，发现该品系已部分地回复为F+状态。但当Aderlberg对这种回复为F+的品系进行分析时，碰到了两个最重要的发现：一是这种F+品系不论是F+→Hfr正方向的或是Hfr→F+反方向的变化过程的频率都远高于一般的F+ Hfr的频率；二是这种F+品系的F因子在回复时有位置特异性，总是整合于它原先整合的位置，即保留着对遗传地点的“记忆”，而不像一般的F因子那样随机整合，因而产生许多种不同的Hfr品系。Aderlberg把这种特殊的F+细菌所携带的已经有了遗传上的修饰的F因子称为F¢因子（F prime factor或F das factor）。为了探明F¢和F因子的区别，他和Jacob一起进行了研究，图示如下：
× tonS
从杂交分析中得出，Hfr F+×F-时其它基因的重组频
率很低，只有大约10-7，只有lac+重组子出现的频率异乎寻常
（F+）
的高，约为10-1，相当于F因子的转移频率。所以他二人立刻假
设F因子从Hfr上游离出来时，将邻近的lac+基因也携带走了，
成为F¢因子。这个带有F¢的F+细菌和F-lac-tons接合时，形成lac+/lac-杂合子。在遗传学上把这两个基因表示为：
部分二倍体（partial
diploid）或部分合子（partial merozygotes）：在细菌接合中含有一个亲本的全部基因组和另一个亲本的部分基因组的存在状态。
性导（Sex duction）或F因子转导（F-factor transduction）：以F¢因子为媒介，使细菌的遗传物质从一个细菌转移到另一个细菌并表现相应性状的过程。
自从A delberg和Jacob发现了F¢以后，相继又发现了许多F¢因子，它们携带了细菌基因组的不同部分。大多数F¢只携带少数几个细菌基因，但也有一些F¢，是带有细菌基因组的1/4的庞然大物。大多数这类F¢因子也许是实验室的珍玩，只有细菌遗传学家对它们感兴趣。但是在F¢(lac+)发现后不久，在日本痢疾病人中分离鉴定出了一种不祥的性因子叫RTF（Resistance Transfer Factor），除带有一组性因子外，还携带着1个以上甚至4个抗药性基因。这是因为日本从40年代起在临床上滥用抗菌素所致。显然，随着这种RTF的出现，对药物的抗性在整个细菌世界中可以象野火般的蔓延。所以在五十年代和六十年代中除停止盲目地宣传抗菌素的神话般的特效性以外，还采取了许多医学细菌学方面的措施才得以改善了这种令人生畏的局面。
通过以上的学习可以看出，从40年代开始直到60年代初期的10多年的时间里，以Lederberg为代表的一些科学家以巧妙的实验设计，并对实验结果进行了严密的推理分析，得出了像E.coli这样的原核生物是有性别的，可进行接合生殖，是异宗配合，但不同于高等生物的有性生殖，而是由一种核外遗传物质——F因子所决定的。现将其存在状态及之间的关系总结如下：
|
性别 |
细菌状态 |
F因子状态 |
|
♀ |
F- |
无F因子 |
|
|
F+ |
F因子游离于细胞质中 |
|
♂ |
Hfr |
F因子整合到宿主染色体上 |
|
|
F¢ |
带有部分宿主染色体的F因子，游离于细胞质中 |
对细菌来说，4种状态，两种性别；
对F因子来说，3种状态；
两种关系：
① 转变关系
F+感染 游离（带宿主部分染色体） F- Hfr F′
整合（原来位置） 游离 吖啶橙处理
②供体——受体之间的关系
F+×F+
不接合（排斥）
F-×F-
不接合（因无F因子为媒介）
F+×F-
接合（低频重组）
Hfr×F+ 接合（高频重组）
F′×F+ 接合（一般为低频重组，但对所携带的基因是高频重组）
（6）F因子的分离
F因子在相当长的一段时间只是根据实验结果提出的一种推测，直到1961年，S.Falkow和L.Baron才分离出F因子，证明了它的存在。
实验材料：E.coli F+，粘质沙雷氏菌（S. marcescens，简作S）。二者属不同的种，但E.coli可把F因子转移给沙氏菌，且可留下来。
方法：
l
E.coli F+×S→SF+
l
将E.coli F+、SF+和 S中的DNA分别提取出来
l
在3种提取物中各添加15N标记的假单孢杆菌的DNA
（已知密度=1.7428g/cm3）作为对照。
l
CsCl密度梯度离心
结果：见图。
纵坐标表示的是在由横坐标所表示的密度梯度处在溶液
中对UV的光密度吸收量（OD值），因而相当于DNA的密度。
从图中可见1.718g/cm3是S的DNA密度。1.709g/cm3
是E.coli F+的DNA密度。SF+的DNA经离心后出现3条带，
一条是对照带，一条是S的DNA带。还有一条副带出现在
1.709处，这无疑是F因子的。证明F因子是DNA，并证实
为6×104bp，约为E.coli染色体的2%（细菌染色体是3×106bp）。
（7）细菌的遗传重组（Genetic recombination of bacteria）
细菌的遗传重组是在部分二倍体（完整的内基因子和不完整的外基因子）中进行的。重组是交换的结果。部分二倍体是怎样发生交换的？
一种是单交换：
部分二倍体线性染色体，以后丢失。
一种是双交换：
重组体
由上可见，细菌的交换有3个特点：
①单交换不能产生完整的重组体，其它奇数交换也不能产生完整的重组体。
②双交换及其它偶数交换可产生平衡的重组体。
③发生偶数交换后只产生一种重组体，相反的重组本不出现，所以在选择培养基上只出现一种重组体。
（8）细菌的重组作图（Recombination mapping of bacteria）
用中断杂交可做细菌的连锁图。但如果二基因靠的很近，如转移时间接近2¢，因时间间隔短，不易掌握，所以就得用传统的重组作图。
如Hfr lac+ ade+
strs×F-lac-ade-strr
从中断杂交实验知道，lac（乳糖发酵基因）和ade（腺嘌呤合成基因）紧密连锁，lac先进入受体，ade居后。
实验步骤：
l
将供体和受体菌在LB中混合培养30¢，使接合。
l
将混合菌液涂布在含Str的EMB（伊红美蓝）基本培养基上。
加str杀死Hfr，F-不能在MM上生长，所以长出的菌落一定是重组体。lac-在EMB上长白色菌落，lac+长的是带金属光泽的暗红色菌落。
l
计算交换值并作图。
部分二倍体中的交换可图示为：
1-2交换 lac+ade-（死） 1-3交换 lac+ade+ 2-3交换 lac-ade+
在lac和ade间发生交换的菌落数
×100% COV(lac-ade)= 菌落总数
lac-ade+
×100% ×100% = = (lac-ade+)+(lac+ade+)
E.coli遗传作图经历了几个重要历史时期：
1947年，Lederberg作的第一张遗传图是：
因为从他的实验中发现，str、mal、thi、xyl、mel都和met连锁。为解释这个矛盾的结果，1951年他提出E. coli的染色体在met基因附近有一个三叉臂。当时有人评论说：“……这也许是他为自圆其说而使的最后一着”。
1957年，Wollman和Jacob通过各种不同品系的Hfr和F-的中断杂交实验，得出E.coli染色体是环状的。大约定位了20多个基因。
1967年，在Jacob和Wollman工作的基础上，又经过不少人的努力，主要是Tomizawa1964年在实验中所探索的部分二倍体重组，最后由Taylor经本人研究，并参考了150多篇文献的报道，给出了一张包括250个基因位置的E.coli遗传图。图距以时间（分钟）为单位，圆图共90¢，把thr基因定在O点。以后每年大约定位20个左右的基因。现在E.coli的基因图已基本清楚了。
（9）转化作图（Transformation mapping）
接合作用和性导是因为有F因子的存在，但有些细菌没有这样的接合系统，就要靠转化进行作图，如枯草杆菌等。
一般来说，转化通常只能整合一小段DNA，不会像接合作用那样携带很多的基因，所以两个或两个以上的基因同时转化就说明它们是紧密连锁的。但有时两个DNA片段可被同一受体所吸收，这样，位于这两个片段上的基因就不是紧密连锁的了。诚然，细菌只有一条裸露的环状DNA分子，其上的基因是全部连锁的，只是紧密程度不同而已。
怎样证明转化的两个基因是紧密连锁的？方法是：
l
抽提供体DNA，和受体一起进行转化，将转化频率记作100；
l
将抽提的供体DNA浓度降低10倍；
如果a、b二基因是紧密连锁的，则a、b二基因同时转化频率也降低10倍。
如果a、b二基因分别位于两个DNA转化片段上，则a、b二基因各自的转化频率也降低10倍，但a、b二基因同时转化的频率则降低10×10=100倍。
由此得出，在较低浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比。
转化作图同样遵循部分二倍体的遗传重组规则。
（10）转导作图（transduction mapping）
细菌杂交发现5年后，J.Lederberg和他的研究生N.Zinder于1951年在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中寻找遗传重组，希望找到一种像Lederberg和Tatum当年在E.coli中发现的接合作用，实验程序和以前的一样，也得到了同样的结果。然而，两种亲本培养物在Davis U形管中的生长表明，与E.coli的接合作用的必要条件相反，这些亲本细菌之间的接触并不是发生重组所必须的。于是他们认为，两种沙门氏菌之间的遗传交换可能是由一种可滤过的因子（filterable agent, FA）为媒介，它小到足以通过U形管中间的烧结玻璃孔（<0.1μm），并将遗传因子从供体带给受体细胞。对FA的进一步研究证明，事实上它就是沙门氏菌的温和噬菌体P22，它们以原噬菌体的形式偶然存在于某一亲本菌株中。得出这样的结论是根据下列FA和P22之间的一致关系：
①P22的侵染性和FA的遗传能力可因DNase的失活而受到保护；
②P22与FA的大小及质量相同；
③FA可被P22抗血清灭活；
④FA与P22有相同的寄主范围。
由此Zinder和Lederberg把以噬菌体为媒介使遗传物质从一个细菌转移到另一个细菌的过程称作转导（transduction）。并认为转导作用是和转化作用或接合作用根本不同的细菌遗传交换的另一种机制。因为由P22噬菌体作媒介的这种转导作用涉及沙门氏菌基因组的任一片断，所以又称作一般性（普遍性）转导（general transduction）。
普遍性转导的过程可用下图来说明：
普遍性转导也常用于紧密连锁的两个以上的基因的作图。由于转导颗粒所带有的供体细菌的染色体片段一般是很短的，所以如果两个基因同时转导的频率较高，就说明它们是紧密连锁的。遗传学上把两个基因同时转导的现象，称为共转导或并发转导（cotransduction）。
转导作图和转化作图一样，都遵循部分二倍体的遗传重组规则。
除普遍性转导外，还有另一类转导叫特定转导（specialized
transduction）或局限性转导（restricted transduction），这类噬菌体只能转导供体菌染色体的限定部分。如温和噬菌体λ是1953年由E.Lederberg首先发现的。它的DNA是线状的，但有粘性末端（cohesive end）可成环状。λ是温和噬菌体，其产生的局限性转导可图示如下：